Development of a model system to study nk cell hyporesponsiveness

Resumen

Natural Killer (NK) cells are cytotoxic lymphocytes important in immune responses to cancer and multiple pathogens because of their ability to kill pathogen infected and tumour cells, and to regulate the function of other immune cells by the secretion of soluble factors. It has been described that chronic activation of NK cells can induce a hyporesponsive state. This situation has been described as one evasion strategy used by tumours or viruses to escape immune system surveillance. The molecular basis of the mechanisms that allows the generation and maintenance of this hyporesponsive state on NK cells are unknown, and the main objective of this thesis was to establish and in vitro system to induce hyporesponsiveness on healthy human NK cells to study the molecular basis of NK cell hyporesponsiveness. IL-2 activated human NK cells treated with ionomycin lose their ability to degranulate when cocultured with diff erent target cells, and to secrete IFN-¿ even after IL-12 and IL-18 sti mulation. However, they are able to degranulate when stimulated through CD16. Cytotoxic and secretory functions were restored by IL-2 stimulation. The expression of activating and inhibitory receptors was normal in ionomycin treated NK cells, however, we observed lower expression of the ¿L, ¿M and ß2 integrins. Study of diff erent NK killing steps demonstrated that ionomycin treated NK cells are less able to form conjugates with target cells. Transcriptomic analysis of activated NK cells treated with ionomycin revealed differential expression of multiple genes; however this transcriptio onal signature was diff erent to those previously defi ned for other hyporesponsive lymphocytes. Treatment of freshly isolated NK cells from healthy donors with ionomycin induces a hyporesponsive state similar to that observed after the treatment of activated NK cells. However, these cells did not recover their ability to degranulate and produce IFN-¿ entirely in the presence of IL-2, and are unable to exert degranulation as effi ciently as control cells when stimulated through CD16. Ionomycin treatment has shown to be an useful tool to understand the NK cell unresponsiveness induced afterer chronic activaton. NK cells. The molecular basis of the lack of response has not been fully elucidated. However the integration of the data described in this thesis provides a conceptual framework that will be useful to understand NK cell biology and NK cell hyporesponsiveness. Las células ¿Natural Killer¿ (NK), son linfocitos citotóxicos capaces de inducir la lisis de células tumorales o infectadas por diferentes patógenos. También pueden regular la función de otras células inmunes mediante la secreción de distintos factores solubles. Sin embargo, una acti vación crónica de las células NK, puede dar lugar a un descenso de su capacidad efectora. Este fenómeno ha sido descrito como una posible estrategia usada por tumores o diferentes virus para escapar de la vigilancia mediada por el sistema inmune. Actualmente se desconocen las bases moleculares de esta pérdida de actividad mantenida en las células NK, así, el objetivo principal de este trabajo fue establecer un sistema experimental para poder inducir y estudiar en células NK humanas de donantes sanos las bases moleculares de esta pérdida de función. El tratamiento de las células NK humanas activadas con IL-2 con ionomicina provoca una pérdida de su capacidad de ejecutar un ataque citotóxico frente a diferentes células diana, y la de secretar de IFN-¿ incluso tras su estimulación con las citoquinas IL-12 e IL-18. Sin embargo, si conservan capacidad de degranular cuando fueron estimuladas a través del receptor CD16. Las funciones citotóxica y secretora pudieron ser recuperadas en estas células cultivándolas en presencia de IL-2. Esta pérdida de función no fue debida a cambios en la expresión de receptores activadores o inhibidores, sin embargo, sí que se observó menor expresión de las integrinas ¿L, ¿M y ß2. El estudio detallado de los distintos pasos del ataque citotóxico, mostró que las células NK desensibilizadas, eran incapaces de formar conjugados con células diana con la misma efi ciencia que las células control. Análisis de la expresión génica de las células NK tratadas con ionomicina, permitió identifi car diferencias en la expresión de múltiples genes, siendo este perfi l génico distinto a los descritos en otras células inmunes que han perdido su funcionalidad. El tratamiento de células NK recién purifi cadas de donantes sanos con ionomicina, les induce un estado de pérdida de respuesta similar al observado en células activadas. No obstante, estas células no recuperan totalmente su capacidad de degranular y de secretar IFN-¿ en presencia de IL- 2; ni son capaces de responder a la estimulación por CD16 de manera tan eficiente como las células recién aisladas control. El análisis de las células NK tratadas con ionomicina, muestra que esta estrategia puede ser un método efi caz para el estudio de la pérdida de función descrita en las células NK tras su estimulación crónica. Aunque más experimentos serán necesarios para lograr entender completamente