Caracterización funcional de mutaciones oncogénicas de pi3k

Resumen

El cáncer es una enfermedad compleja originada por alteraciones genéticas en proto-oncogenes y/o supresores tumorales. El proto-oncogén PI3K se encuentra alterado en numerosos cánceres. La PI3K de clase I son quinasas, formadas por una subunidad catalítica (p110) y una reguladora (p85), que catalizan la conversión de PtdIns(4,5)P2 en PtdIns(3,4,5)P3 en las membranas celulares. Este último es un segundo mensajero que recluta a la quinasa de Ser/Thr AKT, la cual activa a numerosos efectores y desencadena una respuesta proliferativa y de supervivencia celular, por lo que mutaciones que causen la hiperactivación de esta ruta conllevan la transformación de células normales en células tumorales. El supresor tumoral PTEN es el regulador negativo de esta ruta ya que desfosforila el PtdIns(3,4,5)P3 a PtdIns(4,5)P2, contrarrestando la acción de la PI3K. Hemos generado un modelo heterólogo de la levadura Saccharomyces cerevisiae que expresa los principales elementos de la ruta PI3K/AKT de mamíferos, ya que este organismo carece de la señalización a través de PtdIns(3,4,5)P3. En el presente estudio hemos determinado que, entre las diversas isoformas de la subunidad catalítica de PI3K, solo p110¿ y p110ß son lo suficientemente activas per se para eliminar el PtdIns(4,5)P2, que es esencial para la viabilidad de la levadura, cuando son artificialmente dirigidas a la membrana plasmática mediante prenilación (p110¿-CAAX y p110ß-CAAX). En este modelo, demostramos que el dominio ABD (dominio de unión a la subunidad reguladora) de ambas p110 es prescindible para su actividad quinasa de lípidos, mientras que la integridad del dominio C2 (dominio de unión a membranas) es necesaria. Este sistema heterólogo también nos permite estudiar la regulación que ejercen las subunidades reguladoras de la PI3K sobre las catalíticas. Así, hemos observado el efecto activador que las versiones truncadas de las subunidades reguladoras p85¿ y p85ß (p65¿ y p65ß) ejercen sobre la subunidad catalítica p110ß-CAAX, así como la función inhibidora de p85¿ sobre p110¿, lo que se observa sobre una versión miristoilada de esta última. La expresión de p85¿-CAAX inhibe la actividad de p110ß-CAAX y p110¿ miristoilado, pero no contrarresta el efecto activador por reclutamiento a la membrana de p110¿ prenilado, ni de la mutación oncogénica H1047R en p110¿. Al contrario, p65¿-CAAX ejerce un efecto activador sobre p110¿, p110ß y p110¿, pero no sobre p110¿. Este efecto activador requiere de la interacción de p65¿ con el domino ABD de p110¿ mientras que es independiente de la presencia de mutaciones oncogénicas en los dominios helical y quinasa en la misma p110. Además, el efecto activador producido por p65¿-CAAX sobre p110¿ es debido a la actividad quinasa de la PI3K, ya que PTEN revierte su efecto tóxico en la levadura. Por otra parte, la expresión de una serie de mutaciones en p85¿, encontradas en tumores, en el modelo de levadura resulta útil para elucidar si el mecanismo por el cual causan la hiperactivación de la subunidad catalítica es análogo al de p65¿ o divergente, ofreciendo una plataforma para el análisis funcional de mutaciones halladas en la clínica. Por último, en células de mamífero, hemos observado que la sobre-expresión de p65¿ difiere de la de p85¿ y de la del resto de subunidades reguladoras en lo referente a su localización subcelular: p65¿ se acumula en la periferia de endosomas tempranos anormalmente grandes. Esto sugiere que las regiones ausentes en el extremo C-terminal de esta versión truncada son importantes para el control ejercido por p85¿ sobre procesos de tráfico vesicular.