Herramientas genéticas basadas en el enhancer neural de Nestina para la caracterización de las poblaciones endoteliales del corazón : Papel de Sox17 en el desarrollo de la vasculatura coronaria

Resumen

El estudio del origen y desarrollo de la vasculatura del corazón en mamíferos ha sido sujeto de intensas investigaciones en los últimos años, y a pesar de ello, las señales encargadas de regular la formación del plexo coronario siguen estando insuficientemente caracterizadas. En esta Tesis Doctoral se han empleado de forma novedosa las líneas murinas Nes-Gfp y Nes-CreERT2 para dedicarlas al estudio de la formación del endotelio coronario durante el desarrollo cardíaco, con especial énfasis en las fases de remodelado y maduración arterio-venosa. La detallada caracterización realizada del alelo Nes-Gfp durante las etapas intermedias de cardiogénesis, indicaron que se expresa en estirpes mesenquimales del bulbo cardíaco, pericitos y células murales asociadas a los vasos (análogamente al patrón ya descrito en otros órganos), y de modo inesperado y dinámico, su expresión también se induce de manera robusta en el endotelio coronario naciente. Aprovechando dicho patrón de expresión vascular y usando técnicas de clarificación óptica de tejidos completos y microscopia confocal, hemos podido estudiar el proceso de sprouting de los vasos coronarios y el remodelado arterial a alta resolución. Además, gracias a la intensidad relativa de expresión del reportero GFP, en combinación con el marcador Endomucina, nos ha permitido discriminar entre las células de endocardio ventricular (donde la GFP apenas se expresa) y el plexo vascular coronario. Mediante citometría de flujo, logramos aislar ambas poblaciones endoteliales primarias con gran pureza, a partir de los mismos corazones y obtener así los perfiles transcripcionales correspondientes, en diferentes fases de su desarrollo: la etapa inicial de expansión angiogénica (E13.5) y durante el proceso de remodelado activo del plexo primario (E17.5). A su vez, el trazado de linaje usando el driver Nes-CreERT2 (que comparte con la línea Nes-Gfp la presencia de secuencias reguladoras del enhancer neural del gen Nestina), nos permite marcar selectivamente el plexo coronario intramiocárdico enriquecido en endotelio capilar y arteriolar. Por ello, la combinación de ambas herramientas genéticas nos ha permitido aislar y definir transcriptómicamente las tres subpoblaciones de células vasculares sanguíneas presentes en el corazón (endocardio, arterias intramiocárdicas y venas subepicárdicas). Esta estrategia nos permitió identificar nuevos factores enriquecidos en la rama arterial. Entre los genes diferencialmente expresados, hemos encontrado varios miembros de la familia de factores de transcripción SOX, y en especial Sox17. De manera interesante, detectamos expresión nuclear de Sox17 en las primeras células endoteliales del plexo que migraban a través del subepicardio. Más adelante, su expresión se restringe progresivamente en el domino de vasos intramurales Nes-GFP+, con fenotipo arterial. Debido a la robusta co-localización observada entre la población Sox17+ y las células GFP+, nos preguntamos si este factor de transcripción podría ser un activador transcripcional directo del enhancer neural presente en la región reguladora del alelo Nes-Gfp, verificándolo con una serie de ensayos in vitro. Por todo ello, proponemos que el enhancer neural de Nestina también podría actuar como enhancer arterial coronario en determinadas fases del desarrollo cardíaco, y cuyo estudio continuado podría ayudar a descubrir nuevas bases moleculares en este proceso tan importante y relevante para la salud humana, dada la alta incidencia de enfermedad coronaria a escala mundial.