Búsqueda de supresores químicos de la toxicidad de las expansiones CTG en Drosophila

Resumen

INTRODUCCIÓN La Distrofia Miotónica (DM1) es una enfermedad neuromuscular causada por la expansión de repeticiones del triplete CTG en la región 3'UTR del gen DMPK. Los transcritos DMPK mutantes se pliegan a nivel de las repeticiones CUG formando horquillas de ARN de doble cadena que secuestran proteínas nucleares, de entre las cuales destacan los factores de splicing de la famila Muscleblind (Mbl) (Fardaei et al., 2002). El secuestro de las proteínas Mbl es la causa de al menos 126 defectos de splicing en modelos de DM1, razón por la cual se ha acuñado el término spliceopatía para la DM1 (Du et al., 2010). En el año 2006, Mahadevan et al. demostraron que silenciar la expresión de transcritos CUG en ratones modelo adultos podía revertir la mayor parte de fenotipos característicos de la DM1 (Mahadevan et al., 2006). Esto demostró por primera vez que los efectos causados por las expansiones CTG son reversibles y dio lugar a un nuevo impulso en la búsqueda de fármacos anti-DM1. Recientemente, varios laboratorios han desarrollado moléculas capaces de inhibir el secuestro de Mbl por parte de las horquillas formadas por las expansiones CUG in vitro (Arambula et al., 2009; Mulders et al., 2009; Pushechnikov et al., 2009; Wheeler et al., 2009). Sin embargo, hasta la fecha tan sólo uno de estos compuestos ha sido ensayado in vivo, con resultados discretos (Warf et al., 2009). La identificación de moléculas anti-DM1 in vivo supone una gran ventaja al desarrollo de compuestos in vitro. El uso de Drosophila para la búsqueda de compuestos terapéuticos ha experimentado en los últimos años un gran crecimiento debido a su bajo coste de mantenimiento, su corto ciclo de vida y a que posee características ADMET (absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad) propias de un sistema in vivo. En este trabajo, hemos utilizado un modelo de DM1 en Drosophila generado en nuestro laboratorio para llevar a cabo un rastreo de moléculas capaces de suprimir la toxicidad de las expansiones CUG in vivo. Dicho modelo reproduce los aspectos más relevantes de la enfermedad en humanos, incluyendo defectos histológicos en músculo, alteraciones en el Sistema Nervioso y defectos en el splicing alternativo de transcritos diana de Mbl (Garcia-Lopez et al., 2008). RESULTADOS Identificación de un hexapéptido (p88) que suprime la toxicidad de las expansiones CUG en Drosophila: La expresión de un transgén portador de 480 repeticiones CTG (UAS-CTG480) en el cerebro de Drosophila bajo el control de la región reguladora 103Y (103Y-Gal4>UAS-CTG480) causa un fenotipo de letalidad. Para llevar a cabo una búsqueda de compuestos capaces de suprimir la toxicidad de expansiones CUG in vivo administramos de manera oral una colección (quimioteca) de hexapéptidos en formato de rastreo posicional compuesta por 120 mezclas a moscas 103Y-Gal4>UAS-CTG480. El análisis de los resultados dio lugar a un hexapéptido activo (p88) capaz de suprimir la toxicidad de la expresión de CTG480 en el cerebro de manera dependiente de dosis. Para confirmar dicha actividad, administramos p88 a individuos que expresan 480 repeticiones CTG en la musculatura bajo el control del promotor de la cadena pesada de la miosina (MHC-Gal4>UAS-CTG480). De modo similar, el péptido suprimió la toxicidad de CTG480 de manera dependiente de dosis. Para descartar que dicho efecto se debiese a una actividad inespecífica sobre la expresión de transcritos CUG480 llevamos a cabo medidas de RT-PCR de los transcritos CUG480 y la actividad de un gen reportero en moscas modelo tratadas con p88. En ningún caso observamos un efecto inespecífico del péptido sobre la expresión del transgén. Por último, alimentamos a individuos modelo con 5 versiones mutantes del hexapéptido p88, cada una de las cuales contenía una sustitución por alanina en uno de los aminoácidos de la secuencia original. Ninguna de las versiones mutantes suprimió la toxicidad de las expansiones CUG, demostrando que todos los aminoácidos del péptido son necesarios para su función. Con el fin de asegurar la presencia de p88 y los transcritos CUG480 en las mismas células y momentos del desarrollo, generamos líneas transgénicas capaces de expresar p88 de manera endógena utilizando el sistema Gal4/UAS. En este caso, p88 suprimió fenotipos tanto en el ojo como en el músculo. p88 se une a las expansiones CUG y desestabiliza las horquillas tóxicas de ARN: Mediante experimentos experimentos in vitro de polarización de fluorescencia y retardo en gel conseguimos demostrar que p88 de une a expansiones CUG de manera proporcional al número de tripletes. Dicha unión era específica, ya que no se observaba con ninguna de las 5 versiones mutantes del péptido. En estos experimentos comprobamos que p88 no interfiere con la unión de Mbl al ARN. Además, utilizando experimentos de extinción de fluorescencia del triptófano de p88 determinamos que, a pesar de que p88 puede unirse a otros tipos de ácidos nucleicos, lo hace con mayor afinidad por secuencias que contienen repeticiones CUG. Por último, mediante experimentos de dicroísmo circular y extinción de fluorescencia de un ARN CUG de doble cadena marcado con un fluoróforo sensible a la conformación del ARN, encontramos que p88 desestabiliza la estructura secundaria, desplegando las horquillas tóxicas de doble cadena, manteniéndolas en su forma no tóxica de cadena sencilla. De nuevo, este efecto era específico, ya que no ocurría al incubar con versiones mutantes de p88. p88 suprime fenotipos característicos de la DM1 en ratón: Con el fin de estudiar la toxicidad de p88, llevamos a cabo inyección de distintas concentraciones del péptido en ratones de genotipo salvaje. Estos estudios revelaron una dosis letal 50 (LD50) cercana a 100 µg péptido/20 mg por peso de animal. Dosis inferiores no causaron alteraciones graves en los animales. Para validar el efecto de p88 en modelos en mamíferos de DM1 llevamos a cabo experimentos en ratones HSALR (Mankodi et al., 2000). En estos ratones, el péptido suprimió defectos histológicos típicos en la musculatura y alteraciones en el splicing alternativo de los transcritos musculares Serca1 y Tnnt3, ambos dianas directas de Mbl. p88 no afectaba de manera inespecífica al splicing alternativo de dichos transcritos en animales de la cepa savaje, así como tampoco a otros transcritos cuyo procesado es independiente de Mbl (Capzb). En conjunto, estos resultados validan el efecto terapéutico de p88 en mamíferos. DISCUSIÓN p88 es el primer ejemplo de aplicación de una librería combinatoria de hexapéptidos en Drosophila y es la primera molécula desarrollada in vivo con potencial terapéutico para el tratamiento de la DM1. Este péptido suprime fenotipos dependientes de Mbl sin afectar a la función de la proteína en las células, al contrario que la única molécula ensayada in vivo hasta la fecha que tiene como diana los ARN CUG. El hecho de que p88 consiga abrir las horquillas tóxicas implica un efecto directo sobre el origen de la mayoría de síntomas en la DM1. Mejoras de su biodisponibilidad o la síntesis de peptidomiméticos para su futuro posible desarrollo como potencial fármaco.