Ras en el Complejo de Golgiseñales antitumorales mediadas por PTPK

Resumen

I. INTRODUCCIÓN La capacidad para interpretar los diferentes estímulos recibidos del entorno, bien sean factores ambientales, bien señales procedentes de otras células, es una condición sine qua non para la supervivencia celular. El proceso mediante el cual estos estímulos son transformados por la célula receptora en una respuesta biológica, se define como señalización celular. Esta respuesta, está mediada por multitud de cascadas de señalización (Jordan et al., 2000). En eucariotas, aproximadamente un tercio del proteoma está fosforilado, predominantemente en residuos de serina, treonina y tirosina. Esta fosforilación reversible de proteínas, controlada por la actividad de proteínas quinasas y proteínas fosfatasas, es un mecanismo de regulación fundamental en estas rutas de señalización (Cohen, 2001). Las proteínas quinasas activadas por mitógenos ERK 1 y 2 (MAPK), son serina/treonina quinasas implicadas en vías de señalización primordiales en la regulación de procesos fisiológicos tales como proliferación celular, diferenciación, control del ciclo celular, desarrollo y supervivencia (Pearson et al., 2001). Debido a su papel clave en la señalización celular, una regulación rigurosa de estas MAPKs resulta esencial. En consecuencia, una señalización de ERK desregulada o aberrante, da lugar a múltiples estados patológicos que van desde la psoriasis hasta el cáncer (Raman et al., 2007; Robinson and Cobb, 1997). De esta manera, existen en la célula tirosina fosfatasas, serina/treonina fosfatasas y fosfatasas de actividad dual, capaces de defosforilar de manera coordinada, y por lo tanto inactivar, los diferentes componentes de las vías de señalización de las MAPKs (Hornberg et al., 2005). Una de las vías de señalización mejor caracterizadas hasta la fecha, considerada prototipo de las cascadas de señalización, es la ruta Ras-ERK. Las señales transmitidas a través de la familia de las pequeñas GTPasas Ras, desempeñan un papel crítico en multitud de procesos biológicos (Malumbres and Barbacid, 2003). Su importancia en la fisiología celular se pone de manifiesto por los resultados dramáticos de su desregulación; habiéndose descrito la aparición de mutaciones no solapantes en los componentes de esta ruta en casi un 50% de los casos de cáncer humano (Roberts and Der, 2007). Históricamente, se había considerado la asociación a membrana plasmática como un requisito indispensable para la funcionalidad de las proteínas Ras (Willingham et al., 1980). Sin embargo, en las últimas décadas ha quedado firmemente establecido que, además de en membrana plasmática, las proteínas Ras están presentes y son funcionales también en endomembranas como Retículo Endoplásmico, endosomas y Complejo de Golgi (GC) (Fehrenbacher et al., 2009). Por lo tanto, se hace imprescindible abandonar el concepto inicial de la señalización por RAS como un eje lineal único, para empezar a entenderla como un producto de la integración de distintas sub-señales sito-específicas. De este modo, el espacio juega un papel crítico aportando variabilidad de respuesta, en función de las diferentes plataformas de las que emanen las señales RAS. En sus diversas sublocalizaciones: está firmemente establecido que RAS está sujeto a regulación sito-específica por diferentes factores de intercambio (Arozarena et al., 2004; Bivona et al., 2003; Caloca et al., 2003); activa diferentes rutas efectoras (Inder et al., 2008; Matallanas et al., 2006); e induce distintos programas transcripcionales (Agudo-Ibanez et al., 2007). No obstante, la participación de cada una de las sublocalizaciones de Ras en las distintas respuestas biológicas, aún sigue siendo poco clara. Esta incertidumbre, particularmente relevante en endomembranas, resulta especialmente intrigante en el caso del Complejo de Golgi. Al inicio de este proyecto, se sabía que tanto H-Ras como N-Ras, nunca la isoforma más oncogénica K-Ras, estaban presentes y activas en Complejo de Golgi (Choy et al., 1999; Roy et al., 2002). Sin embargo, los datos disponibles en cuanto a la asociación de las señales de Ras originadas en Golgi con la tumorogénesis, se limitaban únicamente a unos pocos estudios en cultivos celulares que habían arrojado resultados poco concluyentes (Chiu et al., 2002; Matallanas et al., 2006). En este trabajo, trataremos de llenar este vacío mediante el uso de diversos modelos celulares y animales con el fin de determinar el papel en cáncer de las señales de Ras originadas desde el Complejo de Golgi. En concreto, los objetivos de esta tesis han sido tres: ¬ Determinar las respuestas biológicas inducidas por las proteínas Ras cuando son activadas en el Complejo de Golgi. ¬ Caracterizar las rutas de señalización que promueven dichas respuestas. ¬ Analizar en un modelo animal el potencial oncogénico de las señales de Ras en función de la especificidad espacial. II. RESULTADOS H-RAS EN COMPLEJO DE GOLGI INDUCE APOPTOSIS Con el fin de obtener una primera visión inicial sobre el papel de las señales de Ras originadas en Complejo de Golgi, decidimos trabajar con la línea celular MCF-7. Esta línea de células epiteliales mamarias, resultaba interesante por presentar un amplio abanico de respuestas ante estímulos diferentes (Nagashima et al., 2007). Para monitorizar la activación de RAS específicamente en Golgi, contábamos con una sonda sito-específica que expresaba el mutante constitutivamente activo de H-Ras fusionado en el extremo N-terminal al receptor KDEL con la mutación N193D (KDELN-HV12). Esta mutación, impide su redistribución al Retículo Endoplásmico, anclándolo de manera permanente al Complejo de Golgi (Cole et al., 1996). Sorprendentemente, la expresión de este constructo en células MCF-7 fue suficiente para inducir una respuesta apoptótica en las células. Igualmente, la sobreexpresión de RAS-GRP1, el factor de intercambio responsable de activar RAS en el GC, indujo fuertemente apoptosis como consecuencia de la activación persistente del RAS endógeno. Finalmente, creciendo nuestros cultivos celulares a 21ºC, bloqueamos el tránsito de las moléculas de Ras recién sintetizado, provocando acumulación de Ras en el GC (Saraste and Kuismanen, 1984). En consonancia con nuestros resultados previos, indujimos apoptosis sólo en aquellas líneas celulares que expresaban mutantes de H y N-RAS, nunca en aquellas mutantes para B-RAF o K-RAS; proteínas ambas que no circulan a través del Complejo de Golgi. CARACTERIZACIÓN DE LAS SEÑALES DE RAS ORIGINADAS EN COMPLEJO DE GOLGI A continuación, nos interesamos en determinar el mecanismo por el cual la activación RAS en el Complejo de Golgi provocaba muerte celular. Curiosamente, la actividad constitutiva de Ras en Golgi resultante de la expresión de KDELN-HV12 se mostró capaz de interferir en la fosforilación de ERK inducida por la estimulación con EGF o la co-transfección con la construcción oncogénica H-Ras-V12. Además, cabe destacar que el efecto inhibidor de Ras desde Golgi se restringía a la ruta de ERK, pues no se observó alteración alguna en la actividad de otras rutas como la vía PI-3K. Por otra parte, utilizando una construcción plasmídica del receptor KDELN unido al dominio catalítico cdc25 del factor de intercambio RAS-GRF1 (KDELN-cdc25) (Herrero et al., 2016), logramos una potente activación de Ras en Golgi. De este modo, observamos que la activación de Ras endógeno en Complejo de Golgi evocaba un efecto supresor sobre la activación de ERK, idéntico al resultante de la expresión ectópica de KDELN-HV12. Por otro lado, puesto que el GC se compone de dos redes funcional y estructuralmente distintas: la red cis Golgi (CGN) y la red trans Golgi (TGN) (Cole et al., 1996), nos resultó interesante determinar desde cuál de estos dos compartimentos estaba Ras ejerciendo su papel supresor sobre la activación de ERK. Dado que KDELN dirige las proteínas a CGN, necesitábamos diseñar una construcción para conducir específicamente H-Ras-V12 a TGN. Con este propósito, empleamos el extremo N-terminal de la proteína SCG-10 (Di Paolo et al., 1997). Así, mientras que KDELN-HV12 inhibió marcadamente la fosforilación de ERK y la actividad inducida por el oncogén H-Ras-V12, SCG10-HV12 se mostró incapaz. Además, tratamos de identificar las moléculas efectoras a través de las cuales, Ras era capaz de inhibir la activación de ERK desde GC, así como confirmar este proceso como la causa subyacente a la entrada en apoptosis. Con este propósito, añadimos la secuencia KDELN a diferentes formas mutantes previamente descritas de H-Ras-V12 que activaban específicamente determinados efectores y no otros (Rodriguez-Viciana et al., 1997). De esta forma, observamos cómo solamente el mutante G37, específico para factores de intercambio de Ral, era capaz de inhibir la activación de ERK; mientras que los mutantes específicos para C-RAF y PI3K, se mostraron completamente ineficaces al respecto. Para corroborar aún más este punto, analizamos también la capacidad para inhibir la activación de ERK de otros efectores de Ras, no caracterizados en cuanto a su respuesta a estas formas mutantes. Así pues, la sobreexpresión de Ral-GDS fue capaz de interferir en la fosforilación de ERK mientras que TIAM-1, RASSF1A, RASSF2 y RIN-1 no produjeron tal efecto. De este modo, todo apuntaba hacia las proteínas RAL-GEFs como únicas responsables de este fenómeno. Finalmente, aunque la sobreexpresión de RAL-GDS no fue suficiente para estimular una respuesta apoptótica en células MCF-7, mostró un efecto sinérgico con H-Ras-V12 capaz de inducir muerte celular. PTPK MEDIA EN LA APOPTOSIS INDUCIDA POR H-RAS DESDE COMPLEJO DE GOLGI Nuestro siguiente objetivo, fue desentrañar el mecanismo mediante el cual las señales de RAS procedentes del Complejo de Golgi eran capaces de inducir apoptosis e inhibir la activación de ERK. Dado que la activación de Ras en dicho orgánulo, no impedía su acceso a otros sistemas de membrana, debía estar ejerciendo su impacto sobre algún punto inferior de la ruta. En un trabajo previo de nuestro laboratorio, habíamos analizado los transcriptomas resultantes de la activación Ras desde cada una de sus sublocalizaciones (Agudo-Ibanez et al., 2007). Curiosamente, uno de los genes específicamente activados por Ras desde Golgi codificaba para PTPK, una tirosina fosfatasa que ya había sido previamente descrita como un mediador esencial para los efectos anti-proliferativos de TGF-B en células MCF-10A (Wang et al., 2005). Cuando probamos si PTPK estaba implicada en la inducción de apoptosis por Ras activada desde Golgi, observamos que la sobreexpresión de PTPK y de KDELN-HV12 en células MCF-7, provocaba niveles similares de muerte celular. Sorprendentemente, la respuesta apoptótica a la sobre-expresión de KDELN-HV12 resultaba completamente suprimida cuando esta construcción se co-expresaba junto con un siRNA dirigido contra PTPK. Analizamos entonces la capacidad de KDELN-HV12 para inhibir la activación de ERK en diferentes líneas celulares, y ésta sólo se produjo en aquellas células donde la activación de Ras en Complejo de Golgi inducía un incremento en los niveles de expresión de PTPK. A continuación, tratamos de averiguar el mecanismo por el cual PTPK pudiera estar inhibiendo la activación de ERK. Para identificar el punto de la ruta Ras-ERK sujeto a la regulación por PTPK, analizamos el grado de fosforilación de los diferentes niveles de la vía bajo condiciones de sobre-expresión de la fosfatasa. Y observamos que un aumento en la expresión de PTPK, reducía significativamente la fosforilación de C-RAF estimulada por Ras y, en consecuencia, los niveles de fosforilación de MEK y ERK. Por el contrario, la sobre-expresión de PTPK no era capaz de inhibir la fosforilación de ERK cuando ésta era inducida por el mutante constitutivamente activo MEK-E, confirmando que PTPK estaba actuando al más alto nivel en la ruta Ras-ERK. No obstante, aún faltaba por demostrar que la respuesta apoptótica inducida por la expresión de PTPK fuera consecuencia directa del impacto negativo sobre la activación de ERK. En consonancia con dicha hipótesis, observamos que la muerte celular inducida por PTPK podía prevenirse mediante la co-expresión de MEK-E. Finalmente, resultados previos de otros laboratorios habían demostrado que las tirosina-fosfatasas se unían a sus sustratos de manera suficientemente estable como para ser detectados por co-inmunoprecipitación (Walia et al., 2014). Así pues, fuimos capaces de detectar la interacción entre PTPKy su supuesto sustrato C-RAF, tanto en condiciones de sobre-expresión, como en proteína endógena. POTENCIAL ONCOGÉNICO SITO-ESPECÍFICO DE RAS EN EL MODELO ANIMAL DE PEZ ZEBRA. Llegados a este punto, los datos obtenidos otorgaban a las señales de Ras originadas desde Golgi un efecto totalmente incompatible con el tradicional papel oncogénico de las proteínas Ras. Por lo tanto, quisimos poner a prueba nuestros hallazgos en un modelo de carcinogénesis animal. Con ese propósito, decidimos utilizar diferentes modelos de melanoma en Pez Zebra. En peces nacre-fish (mitf -/-) (Dorsky et al., 2000), podíamos testar el efecto de potenciales oncogenes expresados específicamente en melanóforos, bajo el control del promotor de MITF. De este modo, probamos la capacidad de H-Ras-V12 para inducir melanoma dependiendo de su sublocalización, y observamos que KDELN-H-Ras-V12 indujo lesiones benignas de una manera mucho menos eficiente que Ras total, o que las construcciones de H-Ras dirigidas a micro-dominios de balsas lipídicas (LCK-HV12) y membrana desordenada (CD8-HV12). Además, mientras que la mayoría de los peces que presentaban lesiones benignas inducidas desde sublocalizaciones de membrana plasmática, principalmente desde membrana desordenada, desarrollaron posteriormente melanoma; ninguno de los tumores benignos inducidos por KDELN-H-Ras-V12 evolucionó a tumor maligno. A continuación, nos preguntamos si el bajo potencial oncogénico de KDELN-H-Ras-V12 en peces estaría relacionado con el efecto negativo sobre la supervivencia celular observado en nuestros modelos celulares. Curiosamente, el número de melanóforos en embriones de peces que sobre-expresaban Ras activo en GC parecía ser significativamente menor respecto al de los embriones control. Sin embargo, cuantificar la apoptosis en Pez Zebra de manera específica para melanóforos resultaba técnicamente muy difícil. Para paliar esta limitación, decidimos sobre-expresar las diferentes construcciones sito-específicas de H-Ras-V12 en células CHL, una línea de células derivadas de melanoma humano. De acuerdo con nuestros resultados anteriores, se observó que la presencia de H-RAS oncogénico en el GC, pero no en otras sublocalizaciones, desencadenaba una potente respuesta apoptótica. VALIDACIÓN DEL PEZ ZEBRA COMO MODELO PARA EL ESTUDIO DE PTPK Queríamos comprobar si PTPK, ejercía la misma función en Pez Zebra que en líneas celulares humanas. Como paso previo a iniciar nuestros experimentos, resultaba esencial conocer el grado de conservación de PTPK entre ambas especies. Y, en este punto, surgió un primer inconveniente: si bien conocíamos la secuencia genómica del Pez Zebra (GRCz10 (GCF_000002035.5)), desconocíamos la secuencia de ADNc. Y, por lo tanto, tampoco conocíamos la secuencia de aminoácidos. De este modo, procedimos a verificar las secuencias pronosticadas por las bases de datos (ZFIN:ZDB-GENE-030131-9834). Como un primer paso inicial, realizamos un alineamiento de la secuencia pronóstico de ADNc con ESTs. Sorprendentemente, observamos un fragmento no reconocido en el extremo 5’. No obstante, mediante predicciones realizadas con software bio-informático, de la secuencia de ADNc se obtenía la estructura característica de una proteína transmembrana. Sin embargo, cuando tratamos de identificar dominios funcionales altamente conservados en la familia R2B de la que forma parte PTPK, la proteína codificada por la secuencia pronóstico de ADNc carecía de los dominios MAM e Ig característicos de estas proteínas (Brady-Kalnay et al., 1993). Así pues, pudiera ser que la secuencia de ADNc pronóstico estuviese incompleta. Al tratar de amplificar por PCR la secuencia codificante para el extremo N-terminal de la proteína en Pez Zebra, obtuvimos un producto de PCR con 1277bp en lugar de los 770bp que esperábamos. Curiosamente, ambas secuencias compartían un 100% de identidad. Por el contrario, los niveles de cobertura no alcanzaban esas cifras debido, de nuevo, a la aparición del fragmento no solapante en el extremo 5’. De este modo, en lugar de una secuencia de 3885bp, la secuencia codificante para PTPK en Pez Zebra parecía estar formada por 4392bp. Alineamos entonces la nueva secuencia con ESTs y el fragmento no reconocido del extremo 5’ desapareció. Además, cuando tradujimos la secuencia de ADNc a aminoácidos, obtuvimos una proteína con todos los dominios característicos de las proteínas R2B. A continuación, procedimos a comparar las secuencias de PTPK en humanos y peces. Cuando alineamos las secuencias de nucleótidos, observamos un 72% de identidad y la cobertura entre ambas fue superior al 95%. Finalmente, cuando alineamos las secuencias de aminoácidos, los niveles de identidad aumentaron hasta más de un 80% sin perder cobertura. PTPK CONTRARRESTA EL POTENCIAL ONCOGÉNICO DE H-RAS DESDE GOLGI Queríamos comprender si, al igual que en nuestros modelos celulares, PTPK pudiera estar involucrado en la regulación de la melanomagénesis inducida por Ras en Pez Zebra. Con este objetivo, diseñamos un sistema CRISPr/Cas9 capaz de interferir con el locus de PTPK y realizamos un primer experimento en la raza jet-fish (Michailidou et al., 2009). Sorprendentemente, la ausencia total de PTPK resultó en un pronunciado incremento en la incidencia de tumores espontáneos característica de este modelo, a diferencia de los peces PTPK +/-, que mostraron la misma frecuencia tumoral que los peces control. Nos decidimos entonces a tratar de silenciar la expresión de PTPK en nacre-fish (Dorsky et al., 2000). Curiosamente, la ausencia de un único alelo de PTPK fue suficiente para posibilitar la melanomagénesis inducida por KDELN-HV12. Este efecto, resultó sin duda mucho más evidente con la ausencia total de fosfatasa en peces PTPK -/-. A raíz de estos resultados, todo parecía sugerir que, en ausencia de PTPK, las señales de Ras originadas en Golgi recuperaban su potencial oncogénico al no resultar inhibida la activación de ERK. En consonancia con esta hipótesis, observamos cómo una reducción progresiva de los niveles de expresión de PTPK venía acompañada de un aumento en los niveles de fosforilación de ERK. Finalmente, en células HeLa, en las que ya habíamos observado que no se detectaba expresión de PTPK, KDELN-HV12 indujo per se una potente fosforilación de ERK. POTENCIAL ANTITUMORAL DE PTPK EN MELANOMA Teniendo en cuenta que N-Ras presenta poblaciones funcionales en Complejo de Golgi capaces de activar cascadas de señalización (Chiu et al., 2002), dado que se habían descrito mutaciones en un 15-20% de los melanomas (Chin et al., 2006) y se había demostrado su implicación en fenómenos de aparición de resistencia a medicamentos (Nazarian et al., 2010); quisimos analizar el comportamiento de N-Ras y su posible relación con PTPK en nuestro modelo de Pez Zebra. Así, analizamos la inducción de melanoma por el mutante constitutivamente activo N-Ras-Q61L y observamos que la pérdida de PTPK aumentaba significativamente la velocidad de formación de tumores, así como la ratio de aparición de los mismos. III. CONCLUSIONES En este trabajo, mostramos cómo la activación de Ras en el Complejo de Golgi es capaz de inducir apoptosis bajo determinados contextos celulares. Esta muerte celular programada, es debida a una inhibición de la activación de ERK. La activación de Ras en Golgi, no impide el acceso de Ras a otras sublocalizaciones celulares. Este efecto inhibidor, emana específicamente de la red cis-Golgi. Además, nuestros resultados señalan a la ruta de las proteínas Ral-GEFs como única responsable de este efecto. PTPK, es la molécula efectora responsable de dicha inducción de apoptosis provocada por la inhibición de la activación de ERK. Concretamente, PTPK repercute negativamente sobre los niveles de fosforilación de C-RAF en residuos de tirosina. En definitiva, nuestros resultados demuestran que el potencial tumorogénico de las proteínas Ras es estrictamente dependiente de la sublocalización celular. Ras activo desde Golgi, se muestra incapaz de fomentar la progresión de melanoma, debido al menos en parte, al efecto supresor ejercido sobre la viabilidad celular. De este modo, PTPK es capaz de contrarrestar, al menos en parte, la melanomagénesis inducida por N-Ras-Q61L confirmando su papel como supresor de tumores. IV. BIBLIOGRAFÍA Agudo-Ibanez, L., Nunez, F., Calvo, F., Berenjeno, I.M., Bustelo, X.R., and Crespo, P. (2007). Transcriptomal profiling of site-specific Ras signals. Cell Signal 19, 2264-2276. Arozarena, I., Matallanas, D., Berciano, M.T., Sanz-Moreno, V., Calvo, F., Munoz, M.T., Egea, G., Lafarga, M., and Crespo, P. (2004). Activation of H-Ras in the endoplasmic reticulum by the RasGRF family guanine nucleotide exchange factors. Mol Cell Biol 24, 1516-1530. Bivona, T.G., Perez de Castro, I., Ahearn, I.M., Grana, T.M., Chiu, V.K., Lockyer, P.J., Cullen, P.J., Pellicer, A., Cox, A.D., and Philips, M.R. (2003). Phospholipase Cg activates Ras on the Golgi apparatus by means of RasGRP1. Nature 424, 694-698. Brady-Kalnay, S.M., Flint, A.J., and Tonks, N.K. (1993). Homophilic binding of PTP mu, a receptor-type protein tyrosine phosphatase, can mediate cell-cell aggregation. J Cell Biol 122, 961-972. Caloca, M.J., Zugaza, J.L., and Bustelo, X.R. (2003). Exchange factors of the RasGRP family mediate Ras activation in the Golgi. J Biol Chem 278, 33465-33473. Chin, L., Garraway, L.A., and Fisher, D.E. (2006). Malignant melanoma: genetics and therapeutics in the genomic era. Genes Dev 20, 2149-2182. Chiu, V.K., Bivona, T., Hach, A., Sajous, J.B., Silletti, J., Wiener, H., Johnson, R.L., 2nd, Cox, A.D., and Philips, M.R. (2002). Ras signalling on the endoplasmic reticulum and the Golgi. Nat Cell Biol 4, 343-350. Choy, E., Chiu, V.K., Silletti, J., Feoktistov, M., Morimoto, T., Michaelson, D., Ivanov, I.E., and Philips, M.R. (1999). Endomembrane trafficking of Ras: the CAAX motif targets proteins to the ER and Golgi. Cell 98, 69-80. Cohen, P. (2001). The role of protein phosphorylation in human health and disease. The Sir Hans Krebs Medal Lecture. Eur J Biochem 268, 5001-5010. Cole, N.B., Smith, C.L., Sciaky, N., Terasaki, M., Edidin, M., and Lippincott-Schwartz, J. (1996). Diffusional mobility of Golgi proteins in membranes of living cells. Science 273, 797-801. Di Paolo, G., Lutjens, R., Pellier, V., Stimpson, S.A., Beuchat, M.H., Catsicas, S., and Grenningloh, G. (1997). Targeting of SCG10 to the area of the Golgi complex is mediated by its NH2-terminal region. J Biol Chem 272, 5175-5182. Dorsky, R.I., Raible, D.W., and Moon, R.T. (2000). Direct regulation of nacre, a zebrafish MITF homolog required for pigment cell formation, by the Wnt pathway. Genes Dev 14, 158-162. Fehrenbacher, N., Bar-Sagi, D., and Philips, M. (2009). Ras/MAPK signaling from endomembranes. Mol Oncol 3, 297-307. Herrero, A., Casar, B., Colon-Bolea, P., Agudo-Ibanez, L., and Crespo, P. (2016). Defined spatiotemporal features of RAS-ERK signals dictate cell fate in MCF-7 mammary epithelial cells. Mol Biol Cell 27, 1958-1968. Hornberg, J.J., Bruggeman, F.J., Binder, B., Geest, C.R., de Vaate, A.J., Lankelma, J., Heinrich, R., and Westerhoff, H.V. (2005). Principles behind the multifarious control of signal transduction. ERK phosphorylation and kinase/phosphatase control. FEBS J 272, 244-258. Inder, K., Harding, A., Plowman, S.J., Philips, M.R., Parton, R.G., and Hancock, J.F. (2008). Activation of the MAPK module from different spatial locations generates distinct system outputs. Mol Biol Cell 19, 4776-4784. Jordan, J.D., Landau, E.M., and Iyengar, R. (2000). Signaling networks: the origins of cellular multitasking. Cell 103, 193-200. Malumbres, M., and Barbacid, M. (2003). RAS oncogenes: the first 30 years. Nat Rev Cancer 3, 459-465. Matallanas, D., Sanz-Moreno, V., Arozarena, I., Calvo, F., Agudo-Ibanez, L., Santos, E., Berciano, M.T., and Crespo, P. (2006). Distinct utilization of effectors and biological outcomes resulting from site-specific Ras activation: Ras functions in lipid rafts and Golgi complex are dispensable for proliferation and transformation. Mol Cell Biol 26, 100-116. Michailidou, C., Jones, M., Walker, P., Kamarashev, J., Kelly, A., and Hurlstone, A.F. (2009). Dissecting the roles of Raf- and PI3K-signalling pathways in melanoma formation and progression in a zebrafish model. Dis Model Mech 2, 399-411. Nagashima, T., Shimodaira, H., Ide, K., Nakakuki, T., Tani, Y., Takahashi, K., Yumoto, N., and Hatakeyama, M. (2007). Quantitative transcriptional control of ErbB receptor signaling undergoes graded to biphasic response for cell differentiation. J Biol Chem 282, 4045-4056. Nazarian, R., Shi, H., Wang, Q., Kong, X., Koya, R.C., Lee, H., Chen, Z., Lee, M.K., Attar, N., Sazegar, H., et al. (2010). Melanomas acquire resistance to B-RAF(V600E) inhibition by RTK or N-RAS upregulation. Nature 468, 973-977. Pearson, G., Robinson, F., Beers Gibson, T., Xu, B.E., Karandikar, M., Berman, K., and Cobb, M.H. (2001). Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions. Endocr Rev 22, 153-183. Raman, M., Chen, W., and Cobb, M.H. (2007). Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene 26, 3100-3112. Roberts, P.J., and Der, C.J. (2007). Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene 26, 3291-3310. Robinson, M.J., and Cobb, M.H. (1997). Mitogen -Activated Protein kinases pathways. Curr Opin Cell Biol 9, 180-186. Rodriguez-Viciana, P., Warne, P.H., Khwaja, A., Marte, B.M., Pappin, D., Das, P., Waterfield, M.D., Ridley, A., and Downward, J. (1997). Role of phosphoinositide 3-OH kinase in cell transformation and control of the actin cytoskeleton by Ras. Cell 89, 457-467. Roy, S., Wyse, B., and Hancock, J.F. (2002). H-Ras signaling and K-Ras signaling are differentially dependent on endocytosis. Mol Cell Biol 22, 5128-5140. Saraste, J., and Kuismanen, E. (1984). Pre- and post-Golgi vacuoles operate in the transport of Semliki Forest virus membrane glycoproteins to the cell surface. Cell 38, 535-549. Walia, V., Prickett, T.D., Kim, J.S., Gartner, J.J., Lin, J.C., Zhou, M., Rosenberg, S.A., Elble, R.C., Solomon, D.A., Waldman, T., et al. (2014). Mutational and functional analysis of the tumor-suppressor PTPRD in human melanoma. Hum Mutat 35, 1301-1310. Wang, S.E., Wu, F.Y., Shin, I., Qu, S., and Arteaga, C.L. (2005). Transforming growth factor {beta} (TGF-{beta})-Smad target gene protein tyrosine phosphatase receptor type kappa is required for TGF-{beta} function. Mol Cell Biol 25, 4703-4715. Willingham, M.C., Pastan, I., Shih, T.Y., and Scolnick, E.M. (1980). Localization of the src gene product of the Harvey strain of MSV to plasma membrane of transformed cells by electron microscopic immunocytochemistry. Cell 19, 1005-1014.