Immunological and pharmacological characterisation of imidazoline receptors and neuroprotective effects of imidazoline drugs in the kainic acid-model of excitotoxicity in mice
- Keller, Benjamin
- Jesús Andrés García Sevilla Doktorvater/Doktormutter
Universität der Verteidigung: Universitat de les Illes Balears
Fecha de defensa: 18 von Juli von 2016
- Luis Felipe Callado Hernando Präsident
- Antonio Miralles Socías Sekretär/in
- Maria Magdalena Sastre Calafat Vocal
Art: Dissertation
Zusammenfassung
En esta Tesis doctoral en Neurofarmacología se plantearon tres objetivos principales, que incluyeron 1) la inmunodetección, caracterización y comparación de proteínas receptoras de imidazolinas (IRs), 2) el estudio de alteraciones de la señalización apoptótica y neurotóxica en cerebro de ratón tras la administración del análogo de glutamato ácido kaínico (KA), y 3) la investigación del potencial neuroprotector de agonistas para los dos subtipos de IR (I1-/I2-IR), que se expresan en cerebro, frente a la excitotoxicidad inducida por KA en ratón. Tres subtipos de receptores para imidazolinas (I1-3-IR) han sido descritos, pero la determinación de las entidades moleculares responsables para la unión de estos fármacos sigue siendo controvertida. En la primera parte de esta Tesis doctoral se caracterizaron varias proteínas IR usando tres anticuerpos diferentes en preparaciones de cerebro, sistemas celulares y tras modulación farmacológica con agonistas de IRs. Los resultados de este estudio indicaron que los receptores del subtipo I1 constituyen un grupo heterogéneo de proteínas relacionadas con nischarin/IRAS (con pesos moleculares de 167 kDa, 105/115 kDa y 85 kDa). En cambio péptidos de 66 kDa, 45 kDa y 30 kDa se relacionaron con el subtipo I2. El I1-IR de 167 kDa, considerado nischarin o IRAS-M, pero ningún otro IR inmunoreactivo, formó parte de complejos protéicos de alto peso molecular y fue sensible a condiciones reductoras. Estudios previos mostraron que la muerte neuronal inducida por KA está mediada principalmente por apoptosis intrínseca o mitocondrial. La segunda parte de esta Tesis doctoral ha investigado la regulación de los principales componentes de la vía extrinseca o mediada por los llamados receptores de muerte en el cerebro de ratones tratados con KA (45 mg/kg, i.p.). Tras una activación de la vía a los 90 min (Fas ligando y agregados de Fas incrementados), KA (72 horas) originó una disminución general en todos los componentes de la vía (Fas ligando, agregados de Fas, FADD, caspasa-8 activada), y, al mismo tiempo, aumentó los niveles de las proteínas anti-apoptóticas FLIPS, p-Akt y p-Ser191 FADD, así como el cociente p-FADD/FADD, un índice de neuroplasticidad. Estos resultados sugieren la inducción de mecanismos de supervivencia para contrarrestar la muerte neuronal retrasada tras la administración de KA. Los efectos neuroprotectores de ligandos selectivos para IRs, como la inhibición de la entrada de iones Ca2+ y de la señalización apoptótica, sugieren que estos fármacos podrían tener un papel protector en el modelo de excitotoxicidad de KA. Por tanto, como tercera parte de esta Tesis doctoral, se investigó el potencial preventivo de pretratamientos repetidos con los agonistas moxonidina (I1-IR), BU224 (I2-IR) y LSL61122 (mixto I1/I2-IR) frente a la señalización neurotóxica inducida por KA. Se realizaron también tratamientos agudos y de combinación con los supuestos antagonistas efaroxan (I1-IR) e idazoxan (I2-IR) para estudiar los mecanismos de acción de los agonistas. Pretratamiento con LSL61122 atenuó el síndrome conductual inducido por KA, mientras que los tres agonistas inhibieron casi completamente la activación de JNK y calpaina así como la fragmentación p35/p25 en el hipocampo tras KA (resultados similares para tratamientos agudos con estos fármacos). Efaroxan e idazoxan, que mostraron actividad agonística, no antagonizaron los efectos de moxonidina y LSL61122 sobre dichas dianas de KA. Preparaciones subcelulares de la corteza cerebral revelaron contenidos reducidos de la proteína synaptosomal PSD-95 (regula la activación de JNK) y un incremento de complejos p35/Cdk5 (con funciones de supervivéncia) tras el tratamiento con moxonidina, BU224 y LSL61122. Estos resultados indicaron el papel neuroprotector de ligandos para los subtipos I1 e I2 de IR (moxonidina y BU224), y especialmente del ligando mixto I1/I2-IR LSL61122, frente a la señalización neurotóxica inducida por KA en el ratón. Además sugieren un potencial terapeútico de fármacos IR en enfermedades asociadas con neurodegeneración mediada por glutamato.