Caracterización Molecular Y Epidemiológica de Cepas Monofásicas de Salmonella Enterica

  1. Laorden Muñoz, Lorena
Dirigida por:
  1. Javier Garaizar Candina Director
  2. Silvia Herrera León Director/a

Universidad de defensa: Universidad del País Vasco - Euskal Herriko Unibertsitatea

Fecha de defensa: 07 de julio de 2014

Tribunal:
  1. Ramón Cisterna Cáncer Presidente/a
  2. Joseba Bikandi Bikandi Secretario
  3. Aurora Echeita Sarrionandía Vocal
  4. Benito José Regueiro García Vocal
  5. María Rosario Rodicio Rodicio Vocal

Tipo: Tesis

Teseo: 117860 DIALNET lock_openADDI editor

Resumen

La salmonelosis, producida por bacterias del género Salmonella, es unade las intoxicaciones alimentarias más comunes en los países desarrolladossiendo la principal manifestación la gastroenteritis aguda. Salmonella entericaes un patógeno conocido desde el siglo XIX y en la actualidad hay descritosmás de 2.500 serotipos. Sin embargo no todos han tenido la misma relevancia ypor tanto, son los más frecuentemente aislados en muestras clínicas los que hanrecibido un control y seguimiento epidemiológico más exhaustivo. Lavirulencia de Salmonella es muy compleja y varía enormemente entre serotiposy cepas dentro de un mismo serotipo.Si bien es cierto que la aparición de nuevas variantes monofásicas no esun evento exclusivo de los últimos años, las herramientas disponiblesactualmente en biología molecular han facilitado la identificación de un mayornúmero de variantes no caracterizadas previamente. El trabajo de esta tesisdoctoral se centró en la caracterización molecular de aislamientos de la variantemonofásica 4,[5],12:i:- del serotipo Typhimurium circulantes en nuestro paísasí como de otros aislamientos monofásicos con importancia clínica en losúltimos años: 4,5,12:b:- y 4,12:d:-, tratando de identificar su posible origenevolutivo. Del mismo modo y como segundo objetivo se planteó el ofrecer lasherramientas epidemiológicas diseñadas y utilizadas en el transcurso de esteproyecto de investigación para favorecer la detección, control y seguimiento deestas nuevas variantes monofásicas.El origen y posterior evolución de las variantes caracterizadas en estetrabajo son el resultado de la evolución biológica fundamentada en lasmutaciones espontáneas, la selección y el aislamiento en las que puede verseimplicada la transposición de elementos genéticos móviles. Los elementosgenéticos transponibles o transposones, se descubrieron por primera vez en ladécada de los 70 siendo la primera secuencia de inserción identificada la IS1 enE. coli. Las secuencias de inserción aparecían como constituyentes normales delcromosoma o de los plásmidos de las bacterias Gram-negativas. Habitualmentelas IS muestran una preferencia en la inserción en determinadas regiones delADN, lo cual sugiere que los extremos terminales de las IS pueden reconocerdeterminadas secuencias diana presentes en el cromosoma durante el proceso deinserción.En este trabajo se han caracterizado cuatro colecciones de aislados conlas fórmulas antigénicas 4,[5],12:i:-, 4,5,12:b:- y 4,12:d:-, mediantefagotipificación, antibiotipificación, PFGE, MLVA, PCR y secuenciación. Conlos datos obtenidos se ha podido concluir que las cepas de las colecciones 1 y 2provienen de Salmonella Typhimurium, sin embargo entre ellas se diferenciandiferentes líneas evolutivas.La primera colección está configurada por un clon procedente de unacepa de Salmonella Typhimurium U302 con plásmido pU302L y con perfil demultirresistencia R- ACSuGSTSxT, donde la tercera copia de IS26 delplásmido pU302L al reconocer una secuencia en el cromosoma originaría ladeleción del flagelo de segunda fase y este evento habría ocurrido al menos entres ocasiones diferentes comenzando siempre la deleción en el mismo punto.La alta homogeneidad detectada las clasifica como pertenecientes a un mismoclon denominado por otros autores cómo clon español. En la segunda colecciónse diferencian las otras dos líneas, dónde las tres primeras cepas de la colecciónson muy similares a las cepas descritas en Estados Unidos y a su vezdiferenciables del resto de aislados de nuestro país, señalando un origen oancestro común con las cepas monofásicas americanas. El resto de cepascaracterizadas en la segunda colección con deleciones de menor tamaño,únicamente comparten entre ellas el perfil de tetrarresistencia y el punto final deinserción de la secuencia IS26 señalando las características principales del cloneuropeo. Sin embargo las diferencias mostradas por el PFGE, MLVA y PCR dela deleción muestran que no comparten un origen común próximo en el tiempopero si están más estrechamente relacionadas entre ellas que con las otras doslíneas descritas. En esta colección se han detectado tres aislados monofásicoscuya fórmula antigénica señala la falta del flagelo de segunda fase, pero porPCR y secuenciación se comprobó que aún conservan el gen fljB seguido devarias secuencias IS26, estas cepas podrían ser similares al ancestro del queevolucionarían las variantes de la colección.Las cepas de Salmonella enterica 4,5,12:b:- analizadas en la terceracolección de este trabajo, son variantes monofásicas provenientes de una terceralínea clonal de Salmonella Paratyphi B dT(+) sin resistencias a antimicrobianos,con la excepción de una cepa que no es capaz de metabolizar el tartrato (dT-),que provendría de Salmonella Paratyphi B dT(-). A pesar de habercaracterizado la deleción en la mayoría de los aislados no se han obtenidosuficientes datos que permitan conocer el evento genético implicado en lamisma. La mayoría presentan una deleción de 27 genes adyacentes al gen fljB,la cual pudo ser ocasionada por una transposasa, pero que posteriormenteperdió parte de su estructura dejando un fragmento inservible de 281 pb. ElPFGE muestra una elevada diversidad entre las cepas de esta variante. Sinembargo dentro del pulsotipo A, las cepas presentaron una alta homología eincluso son las que presentaron la deleción descrita. Entre los otros cuatropulsotipos se engloban las cepas cuya deleción no se pudo caracterizar, por loque nos llevó a concluir que estas 10 cepas podrían pertenecer a diferenteslíneas evolutivas y por lo tanto presentar diferentes tipos de deleciones de losgenes implicados en la síntesis del flagelo de segunda fase.Las cepas de Salmonella enterica 4,12:d:- que configuran la cuartacolección son variantes monofásicas provenientes de SalmonellaSchwarzengrund, altamente homogéneas por lo que podrían configurar unmismo clon y en cuyo caso la deleción de once genes entre los que seencuentran los genes implicados en la síntesis del flagelo de segunda fase, fueoriginada por una IS30. Esta variante mostro una alta homogeneidad tanto enlos datos de PFGE, como antibiograma y como en el tipo de delecióncaracterizada. El final de la inserción de la IS30 coincide en el mismonucleótido que el final de la inserción descrito en las cepas del clon europeo.Finalmente como conclusión a este trabajo podemos afirmar que la zonade síntesis del flagelo de segunda fase supone un punto caliente para lasinserciones de secuencias de inserción o transposones afectando a la capacidadde síntesis de la flagelina de segunda fase en cepas de Salmonella enterica. Sinembargo, esta deficiencia, no ha supuesto una desventaja evolutiva para estetipo de variantes.Salmonelosia, Salmonella generoko bakterioak eragindako janariintoxikazio ohikoenetariko bat da herrialde garatuetan eta gastroenteritiszorrotza da manifestazio nagusia. Salmonella enterica XIX mendetik ezagunaden patogeno bat da, eta gaur egun 2.500 serotipoak baino gehiago deskribatutadaude. Hala ere, guztiak ez dute garrantzi bera izan, eta lagin klinikoetan maizisolatuak direnak izan dira kontrol eta segimendu epidemiologiko sakonagoajaso dituztenak. Salmonella-ren birulentzia oso konplexua da eta ikaragarrialdatzen da serotipoen eta serotipo beraren barruan dauden anduien artean.Bariante monofasiko berrien agerpena azken urteen esklusiboa ez izanarren, gaur egun biologia molekularrean eskuragarri dauden erremintak erraztudute aurrez karakterizatu gabe zeuden barianteen gehiagoren identifikazioa.Doktore-tesi honen lana oinarritu zen gure herrialdean zirkulatzaileak direnTyphimurium serotipoko 4,[5],12:i:- bariante monofasikoaren isolatuenkarakterizazio molekularrean, baita azken urteetan garrantzi klinikoko besteisolamendu monofasikoena: 4,5,12:b:- eta 4,12:d:- isolatuena, bere jatorriebolutibo posiblea identifikatzen saiatuz. Era berean eta bigarren helburu bezalaikerkuntza proiektu honetan zehar diseinatutako eta erabilitako erremintaepidemiologikoak eskaintzea bariante monofasiko berri hauen detekzioa,kontrola eta segimendua hobetzeko.Lan honetan karakterizatutako barianteen jatorria eta eboluzioa,mutazioen, hautespen-naturalaren eta isolamenduaren ondorioa dira, hain zuzenere elementu genetiko mugikorren transposizioaz eraginda izan daitezkela.Elementu genetiko transposagarriak edo transposonak 70. hamarkadan aurkituziren eta IS1 izan zen identifikatutako lehenengo insertzio sekeuntzia, E. coli-n.Insertzio-sekuentziak Baketrio Gram-negatiboen kromosomaren edoplasmidoen osagai arruntak bezala agertzen ziren. Normalean IS-ak DNArenzonalde konkretuekiko preferentzia. Normalean IS-ek lehentasuna erakustendute DNAko eskualde zehaztuetan txertatzeko, zeinek iradokitzen du IS-enmutur terminalek zenbait itu-sekuentzia ezagutu ditzaketela kromosomanzeharreko txertatze-prozesuan.Lan honetan 4,[5],12:i:-, 4,5,12:b:- eta 4,12:d:- formula antigenikoekikolau isolatuten bildumak karakterizatu dira, fagotipifikazioaren,antibitipifikazioaren, PFGE-a, MLVA, PCR-a eta sekuentziazioaren bitartez.Lortutako datuekin 1 eta 2 bildumetako anduiak Salmonella Typhimurium-etikdatozela ondorioztatu ahal izan da, hala ere haien artean lerro ebolutibodesberdinak bereizten dira.Lehen bilduma osatzen duen klonak, Salmonella Typhimurium U302fagotipodun andui batetik dator, pU302L plasmidoarekin eta R-ACSuGSTSxTerresistentzia anitzetako profilarekin, bertan pU302L plasmidoko IS26-renhirugarren kopiak kromosomaren sekuentzia ezagun bat detektatzean bigarrenfaseko flageloaren delezioa sortuko lukeen toki horretan txertatu ondoren etagertaera hau gutxienez hiru aldi desberdinetan gertatuko zen baina delezioarenhasiera beti puntu berean izango zen. Antzemandako homogeneotasun altuasailkatzen ditu andui hauek klon bereko kideak bezala, eta beste egile batzuekklon espainiarra bezala izendatu dute. Bigarren bilduman beste bi lerroakbereizten dira, non bildumako lehenengo hiru anduiak oso antzekoak direnEstatu Batuetan deskribatutako anduiekin eta berriz, jatorria edo anduimonofasiko amerikarrekiko arbaso komuna seinalatuz, eta gure herrikogainerako anduietatik diferentziatuz. Bigarren bilduman tamaina txikiagokodelezioekin karakterizatutako gainerako anduiek, haien artean bakarrik dutekomunean tetraerresistentzia-profila eta IS26 sekuentziaren txertaketarenamaiera-puntua, klon europarraren ezaugarri nagusiak seinalatuz. Hala erePFGE-ak, MLVA-k eta delezioaren PCR-ak erakutsitako desberdintasunek,adierazten dute ez dutela denbora hurbilean jatorri komuna, baina haien arteanbadaude hertsikiago erlazionatuta deskribatutako beste bi lerroekin baino.Bilduma honetan hiru isolatu monofasiko detektatu dira eta formulaantigenikoan bigarren faseko flageloaren gabezia seinalatzen da, baina PCRreneta sekuentziazioaren bidez egiaztatu da fljB genea oraindik mantentzen dutelahainbat IS26 sekuentziaz jarraituta, andui hauek bildumaren barianteekeboluzionatuko luketen arbasoaren antzekoak izan litezke.Salmonella enterica-ko 4,5,12:b:- anduiak lan honen hirugarrenbilduman analizatuta, Salmonella Paratyphi B dT(+)-ren hirugarren lerroklonaletik datozten bariante monofasikoak dira eta antibiotikoekiko aurkakoerresistentziarik gabe. Dena den, salbuespena, tartratoa metabolizatzekogaitasuna ez duen anduia (dT-) Salmonella Paratyphi B dT(-)-tik etorrikolitzateke. Delezioa isolatu gehienetan karakterizatu arren, ez dira datu nahikoriklortu delezioan inplikatutako gertaera genetikoa ezagutzeko. Isolatuengehiengoak fljB genearen alboko 27 generen delezioa aurkezten dute. Delezioatransposasa batek eragin ahal izan zuen, baina geroago bere egituraren zati batgaldu zuen 281 bp-eko zati erabilezina utziz. PFGE-ak bariante honetakoanduien arteko aniztasun handia erakusten du. Hala ere A pultsotipo barruan,anduiek homologia altua aurkeztu dute eta gainera deskribatutako delezioaaurkeztu zutenak dira. Beste lau pultsotipoen artean biltzen dira karakterizatugabeko delezioa zuten anduiak. Ondorioztatu genuen beraz, 10 andui haueklerro ebolutibo desberdinetakoak izan litezkeela eta ondorioz, bigarren fasekoflageloaren sintesian inplikatutako generen delezioaren mota desberdinakaurkeztea.Salmonella enterica-ko 4,12:d:- anduiak laugarren bilduma osatzendutenak Salmonella Schwarzengrund-etik datozten bariante monofasikoak diraeta oso homogeneoak direnez, klon bera osatu lezakete. Delezionatu direnhamaika generen artean bigarren faseko flageloaren sintesian inplikatutakogeneak aurkitzen dira eta delezioa IS30 batek sortu zuen. Bariante hauhomogeneotasun altua erakutsi du PFGE zein antibiograma-datuetan, baitakarakterizatutako delezio motan ere. Beste aldetik, IS30-aren txertatzearenamaiera muturra klon europarraren anduietan deskribatutako nukleotidoberarekin bat dator.Azkenik, lan honen konklusio bezala baiezta dezakegu bigarren fasekoflageloaren sintesiaren zonaldea insertzio-sekuentzien edo transposonentxertaketarako puntu beroa dela eta Salmonella enterica-ko anduietan bigarrenfaseko flagelinaren sintesi-ahalmenean eragiten dutela. Hala ere, huts honek ezdu desabantaila ebolutiboa ekarri bariante-mota hauetarako