Role of sphingolipids and oxidative stress in the antineoplasic activity of 4-hprstudy in a leukemia model

Resumen

La N-(4-hidroxifenil)retinamida (también denominada 4-HPR o fenretinida) es un derivado sintético del ácido retinoico (AR) el cual es a su vez, derivado natural de la vitamina A (Costa et al., 1994). El todo-trans-ácido retinoico (ATRA) se utiliza como tratamiento de referencia en algunos tipos de cáncer, en especial, en la leucemia promielocítica aguda (APL; Ades et al., 2010). Su carácter antineoplásico se debe a su capacidad para inducir diferenciación celular mediante su unión a receptores nucleares (receptores de ácido retinoico o RAR, receptores de X retinoico o RXR) y activación de factores de transcripción (Fontana & Rishi, 2002; Blomhoff & Blomhoff, 2006). Sin embargo, una de sus mayores limitaciones se halla en la aparición del llamado Síndrome del Ácido Retinoico, que se da hasta en un 25% de los casos y puede causar la muerte (Patatanian & Thompson, 2008). El desarrollo de retinoides sintéticos y en especial del 4-HPR supuso un gran avance debido a que presenta 1) un patrón de toxicidad favorable (Rotmensz et al., 1991; Costa et al., 1994), 2) capacidad de inducir muerte celular en vez de diferenciación (Ponzoni et al., 1995; Kitareewan et al., 1999) y 3) efectividad sobre neoplasias que muestran resistencia al AR (Delia et al., 1993; Kitareewan et al., 1999; Reynolds et al., 2000). Son numerosos los estudios in vitro que han demostrado la efectividad de la 4-HPR no sólo como quimiopreventivo sino también como quimioterapéutico en neoplasias de muy diversa índole (desde leucemias hasta células tumorales de ovario, mama o cerebro; Asumendi et al., 2002; Simeone et al., 2006; Appierto et al., 2007; Corazzari et al., 2007). Dichos resultados han dado lugar a numerosos ensayos clínicos (Children's Oncology Group (CCG 09709) et al.., 2006; Veronesi et al., 2006; Sabichi et al., 2008) que en su conjunto apoyan el gran potencial antineoplásico de la 4-HPR. En relación al mecanismo de acción del mismo, nuestro grupo y otros han resaltado la importancia del proceso apoptótico inducido por la 4-HPR así como del papel que juega el daño mitocondrial en dicho proceso (Suzuki et al., 1999; Asumendi et al., 2002; Hail et al., 2009; Cuperus et al., 2010). En cuanto a los eventos iniciales mediados por la 4-HPR, estudios previos de nuestro grupo señalan que en líneas de leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T), la 4-HPR induce un rápido incremento de especies reactivas de oxígenos (ROS) así como de ceramidas intracelulares (Asumendi et al., 2002, Morales et al., 2007) La acumulación masiva de ROS refleja un estado de estrés oxidativo que en caso de no ser neutralizado, genera daños a todos los niveles celulares (e.g. membranas, DNA) y causa la muerte celular (Trachootham et al., 2008). Por su parte, se ha descrito que los ceramidas (fosfolípidos pertenecientes a la familia de los esfingolípidos), juegan un importante papel como moléculas de señalización en procesos ligados a la muerte celular (Hannun & Obeid, 2002). Estos y otros datos, en concordancia con resultados de otros estudios en diferentes modelos celulares (Maurer et al., 1999; Suzuki et al., 1999; Hail & Lotan, 2001; Wang et al., 2001; Asumendi et al., 2002; Erdreich-Epstein et al., 2002; Lovat et al., 2002,; O'Donnell et al., 2002; Rehman et al., 2004; Morales et al., 2007; Wang et al., 2008) señalan la importancia del estrés oxidativo y la alteración de los esfingolípidos intracelulares en el proceso apoptótico inducido por la 4-HPR. Por otra parte, la resistencia adquirida a la 4-HPR es, al día de hoy, un campo poco estudiado hasta el momento si bien la resistencia (adquirida o natural) frente a los quimioterapéuticos es actualmente la principal causa del fracaso de los tratamientos (Longley & Johnston, 2005). En este aspecto, los escasos datos disponibles hasta el momento apuntan hacia cambios en la acumulación intracelular de la 4-HPR (Appierto et al., 2001) o en el metabolismo de los esfingolípidos (Prinetti et al., 2003) como posibles fuentes de resistencia. En base a lo mencionado, los objetivos generales de este proyecto de tesis han sido los siguientes: 1) Determinar el peso específico que tienen los eventos más tempranos (i.e. incremento de los ROS y cerámicos intracelulares) en la actividad antineoplásica de la 4-HPR 2) Establecer la posible interacción entre el estrés oxidativo y el metabolismo de esfingolípidos 3) Generar un modelo de estudio de LLA-T con resistencia adquirida a la 4-HPR 4) caracterizar el modelo de LLA-T con resistencia adquirida, incluyendo posibles tratamientos alternativos. Los datos obtenidos demuestran que la 4-HPR induce una rápida modulación de la ruta de síntesis de novo de los esfingolípidos. Dicha modulación ocurre de forma tiempo y dosis-dependiente y es consecuencia de la inhibición de la dihidroceramida desaturasa (DES), enzima encargada de la desaturación de las dihidroceramidas y consecuente formación de ceramidas. Estos datos, acordes con otros recientemente publicados en otros modelos celulares (Kraveka et al., 2007; Wang et al., 2008; Valsecchi et al., 2010), indican que a diferencia de lo mencionado anteriormente, son dihidroceramidas (y no ceramidas) las especies de esfingolípidos acumuladas. En cuanto al papel que los dihidroceramidas juegan en la muerte celular mediada por 4-HPR, observamos que el bloqueo completo de la síntesis de novo previo al tratamiento con 4-HPR evita la acumulación de dihidroceramidas sin cambiar el patrón de muerte celular. Junto a ello, antioxidantes generales como el ácido ascórbico, -tocopherol o Trolox (derivado sintético del -tocopherol) previenen la muerte celular mediada por 4-HPR aún en presencia de la acumulación de dihidroceramidas. Estos datos han sido claves para determinar que al contrario de lo estipulado anteriormente, el efecto de la 4-HPR sobre los esfingolípidos no es causa directa de la muerte celular observada. En relación a la actividad prooxidante de la 4-HPR, nuestros datos demuestran que induce una rápida generación de especies reactivas de oxígeno, tanto inorgánicas (e.g. superóxido, hidrógeno peróxido) como orgánicas (e.g. peroxidación lipídica). El estrés oxidativo general atiende a un patrón tiempo y dosis-dependiente si bien difiere del patrón rápido y sostenido del superóxido mitocondrial. En concordancia con numerosos estudios (Maurer et al., 1999; Suzuki et al., 1999; Hail & Lotan, 2001; Asumendi et al., 2002; Lovat et al., 2002), y tal como se ha mencionado en el párrafo anterior, antioxidantes generales como el ácido ascórbico, -tocopherol o Trolox inhiben el proceso apoptótico mediado por la 4-HPR. Sin embargo, la utilización de antioxidantes generales no permite conocer el origen del estrés oxidativo. La lipoxygenasa-5 pudiera ser una diana a tener en cuenta en nuestro modelo celular de LLA-T en base a la capacidad del un inhibidor de la misma (NDGA) para bloquear tanto los ROS iniciales como eventos oxidantes más tardíos. Sin embargo, el efecto parcial de la NDGA sobre la viabilidad celular deja entrever que, si bien los ROS son importantes en la actividad de la 4-HPR, por sí mismos no explican todo su efecto antitumoral. En cuanto a la posible interacción entre el estrés oxidativo y la modulación de niveles de dihidroceramidas observados, hemos demostrado, tanto con ensayos in situ como in vitro, que el estrés oxidativo inhibe la actividad DES. En este punto cabe recalcar que según los datos obtenidos, la inhibición es el resultado de una modulación indirecta de los agentes prooxidantes (e.g. hidrógeno peróxido, tert-butil-hidroperóxido, menadione) concordante con la reducción de tioles celulares y sin aparente degradación de la enzima. El análisis del patrón de esfingolípidos en células de LLA-T con resistencia adquirida a la 4-HPR (generados en nuestro laboratorio) ha permitido determinar que al contrario de lo mencionado por Prinetti et al. (2003), la 4-HPR induce cambios similares en células sensibles y resistentes a la misma. Las células resistentes a la retinamida y permanentemente expuestas a la droga, muestran un patrón general de esfingolípidos acorde con una inactivación continuada de la actividad DES. Es más, los resultados indican que el perfil de esfingolípidos mostrado por las células resistentes es de carácter reversible e independiente del fenotipo de resistencia. Nuestra labor en la descripción de posibles terapias alternativas en casos de resistencia adquirida muestra la eficacia de moduladores de las rutas de esfingolípidos tanto frente a células de LLA-T sensibles como resistentes a la 4-HPR. Junto a ello, hemos observado que afortunadamente, células LLA-T resistentes a la retinamida mantienen la sensibilidad frente a otros quimioterapeúticos de uso habitual como el paclitaxel, doxorubicina hidrocloruro (adriamicina) o el cisplatino. En su conjunto, estos datos apoyan la potencialidad de la 4-HPR como quimioterapéutico en LLA-T, no sólo por su capacidad para inducir la muerte en células neoplásicas sino también por la falta de resistencias cruzadas con otros compuestos. A modo de resumen, las conclusiones de la presente tesis doctoral son las siguientes: 1- La N-(4-hidroxifenil)retinamida (4-HPR, fenretinida) induce un cambio profundo en el contenido celular de esfingolípidos en líneas celulares humanas de leucemia linfobástica aguda. Dicho cambio se observa tanto en líneas celulares sensibles (CCRF-CEM, Jurkat) como resistentes (R0.5, R3, R5, R10) a la fenretinida y se caracteriza por la acumulación de dihidroceramidas endógenas y especies precursoras junto con el descenso en el nivel de ceramidas y esfingolípidos glucosilados (glucosilceramidas, lactosilceramidas). A pesar de ser evidente, la alteración en los niveles de esfingolípidos celulares es independiente de la citotoxicidad aguda mediada por 4-HPR en células de leucemia. 2- La N-(4-hidroxifenil)retinamida provoca un incremento temprano y general de procesos oxidantes caracterizado por la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) propias de la mitocondria y así como no específicas de la misma. Los datos obtenidos indican que las especies reactivas de oxígeno (i.e. H2O2 y peróxidos de lípido) son buenos indicadores de la toxicidad de la 4-HPR en nuestro modelo. Sin embargo, la producción de ROS, por sí mismo, no es suficiente para explicar la muerte celular aguda inducida por 4-HPR. 3- Los cambios en el perfil de esfingolípidos tras la exposición a 4-HPR se deben a la inhibición de la dihidroceramida desaturasa (DES). Junto a ello, el estrés oxidativo inhibe de forma indirecta la actividad de la DES. En su conjunto, los datos sugieren que la inhibición de DES mediada por la fenretinida es debida a la actividad prooxidante de la misma. 4- La exposición continuada de células de leucemia linfoblástica aguda (CCRF-CEM) a la 4-HPR conduce a la formación de líneas con resistencia adquirida. Los perfiles de esfingolípidos en células con resistencia adquirida (R0.5, R3, R5, R10) son similares a las observadas en las células progenitoras (CCRF-CEM). La alteración del patrón de esfingolípidos es un evento reversible e independiente del desarrollo de resistencia a la 4-HPR. 5- Nuestro modelo de leucemia con resistencia adquirida a la 4-HPR no muestra fenotipo acorde con resistencia multidroga. Células con resistencia a altas concentraciones de 4-HPR son sensibles a moduladores de esfingolípidos/proteína kinasa C así como a tratamientos de uso corriente en clínica (e.g.paclitaxel, cisplatino, adriamicina). En base a los datos mencionados, leucemias linfoblásticas agudas con resistencia a la 4-HPR podrían ser tratadas con otros agentes antineoplásicos.