Modulation of brain endocannabinoid system and therapeutic potential of monoacylglycerol lipase blockade during demyelination in vivo

Resumen

La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) más común en adultos jóvenes, afectando a más de 2,5 millones de personas en todo el mundo. La EM es una enfermedad compleja de características histopatológicas heterogéneas, cuyos principales mecanismos etiopatogénicos son desmielinización (destrucción de las vainas de mielina y muerte de oligodendrocitos), inflamación (infiltración de células del sistema inmune periférico y gliosis) y degeneración neuronal, que dan lugar a los síntomas de la enfermedad. La EM se caracteriza asimismo por la presencia en las lesiones desmilinizantes de células precursoras de oligodendrocitos. Estas células se diferencian a oligodendrocitos maduros, observándose cierto grado de remielinización, si bien este proceso no se completa con éxito y no es capaz de compensar la progresión de la enfermedad. Se han descrito diferentes patrones celulares en las lesiones de la EM. En los patrones I y II predomina la inflamación mediada por el sistema inmune periférico, principalmente por células T autorreactivas, mientras que los patrones III y IV presentan características de una oligodendrogliopatía primaria, similares a los observables en procesos de desmielinización inducida por virus o toxinas. En base a los hallazgos histológicos de las lesiones tipo I y II, la EM se ha considerado clásicamente una enfermedad de carácter autoinmune mediada por células T autorreactivas frente a componentes de la mielina. Sin embargo, la muerte oligodendroglial y la disfunción axonal primarias también se postulan hoy en día como mecanismos etiopatogénicos claves en esta enfermedad.Independientemente del evento patogénico primario, el proceso inflamatorio es clave en la evolución de la EM. Los ataques inflamatorios se caracterizan por la infiltración en el sistema nervioso central (SNC) de células del sistema inmune, principalmente linfocitos T CD8+, macrófagos y neutrófilos asociada a la ruptura de la barrera hematoencefálica. El proceso inflamatorio conlleva la activación de microglía y astrocitos en las áreas lesionadas. Estas2células producen citoquinas y otros mediadores pro-inflamatorios y tóxicos como las especies reactivas de oxígeno y las prostaglandinas, aunque también factores tróficos y de diferenciación implicados en los procesos de remielinización.La muerte celular por excitotoxicidad es un mecanismo etiopatogénico bien establecido en la EM y otras enfermedades neurodegenerativas. El sistema glutamatérgico se encuentra alterado en modelos animales de EM como la encefalitis experimental autoinmune (EAE) y en los propios pacientes, y tanto neuronas como oligodendrocitos son sensibles al daño excitotóxico por sobreactivación de receptores ionotrópicos de glutamato de tipo AMPA y NMDA, o bien de receptores de ATP de tipo P2X7. El bloqueo farmacológico de los receptores AMPA mejora los déficits neurológicos asociados a la EAE. Sin embargo, el papel de los receptores P2X7 en este modelo animal de EM es más controvertido. Además de mediar daño celular en neuronas y oligodendrocitos, los receptores P2X7 regulan la función de células del sistema inmune periférico y microglía de manera compleja, puesto que su activación puede promover la liberación de moléculas pro-inflamatorias o anti-inflamatorias, como es el caso de los endocannabinoides.El sistema endocannabinoide cerebral es un sistema de neuromodulación implicado en una gran variedad de funciones fisiológicas y fisiopatológicas. Este sistema está constituido por los receptores cannabinoides CB1 y CB2, sus ligandos endógenos denominados endocannabinoides, y las enzimas responsables de la síntesis y degradación de estos compuestos. Los receptores cannabinoides son la diana farmacológica del ¿9-THC, principal componente psicoactivo de la planta de marihuana Cannabis sativa, y median la mayor parte de los efectos asociados a su consumo. Los principales endocannabinoides son la araquidonoiletanolamida (AEA, anandamida) y el 2-araquidonoilglicerol (2-AG). La AEA y el 2-AG son mediadores lipídicos que se sintetizan ¿bajo demanda¿ a partir de precursores específicos por acción de las3enzimas NAPE fosfolipasa D (NAPE-PLD) y diacilglicerol lipasa (DGL), respectivamente. Los niveles de estos endocannabinoides se encuentran asimismo estrictamente regulados mediante degradación enzimática por enzimas específicos entre los que destacan la amidohidrolasa de ácidos grasos o FAAH en el caso de la AEA, y la monoacilglicerol lipasa o MAGL para el 2-AG. Los receptores CB1 se expresan abundantemente en el SNC, y su localización es fundamentalmente neuronal, aunque también se ha demostrado su expresión en astrocitos, oligodendrocitos y microglía. Los receptores CB2 se expresan principalmente en el sistema inmune periférico, y en menor grado en células gliales, aunque en situaciones inflamatorias su expresión aumenta en microglía y en los astrocitos.Ambos ligandos endocannabinoides activan receptores CB1 y CB2, si bien lo hacen con diferente afinidad y producen diferentes efectos fisiológicos. Los receptores cannabinoides están acoplados a proteínas Gi/o por lo que su activación inhibe la producción de AMPc, y en el caso de los receptores CB1, regula negativamente canales de Ca2+. A nivel neuronal los endocannabinoides actúan de forma retrógrada, liberándose desde el terminal postsináptico activando los receptores CB1 localizados en el terminal presináptico e inhibiendo así la liberación de neurotransmisores, tanto inhibitorios como excitatorios. Además, ambos receptores cannabinoides activan en distintos tipos celulares vías de supervivencia y diferenciación, y pueden promover la muerte de células del sistema inmune. El sistema endocannabinoide juega un papel importante en procesos neuroinflamatorios y neurodegenerativos, y se han demostrado efectos beneficiosos de agonistas cannabinoides exógenos a nivel preclínico frente a una gran variedad de enfermedades del SNC, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer, el daño traumático e hipóxico isquémico. Las alteraciones del sistema endocannabinoide y los efectos terapéuticos del ¿9-THC y otros agonistas cannabinoides son bien conocidos en modelos animales de EM con4un componente etiopatogénico autoinmune importante, como la EAE. Sin embargo, no existen datos relativos a la implicación del sistema endocannabinoide en modelos animales de desmielinización primaria. Por otro lado, el uso clínico de cannabinoides exógenos se asocia a la aparición de efectos adversos asociados a la activación de receptores CB1, y entre los que destacan las alteraciones cognitivas y de la memoria. Una estrategia alternativa para potenciar la señalización a través de los receptores cannabinoides minimizando a la vez la aparición de efectos secundarios es la potenciación del tono endocannabinoide endógeno. En este contexto, los inhibidores de la degradación enzimática de AEA y/o 2-AG se proponen hoy en día como posibles terapias para el tratamiento de distintas enfermedades del SNC.OBJETIVOSEn el presente trabajo de tesis doctoral hemos querido caracterizar en primer lugar la posible implicación del sistema endocannabinoide endógeno en los procesos de desmielinización primaria y remielinización in vivo. Con este objetivo hemos analizado los cambios en la expresión de los receptores cannabinoides CB1 y CB2, en los niveles de endocannabinoides, y en la expresión de las principales enzimas de síntesis y degradación de estos compuestos, en el modelo de desmielinización por administración de cuprizona en la dieta. Por su papel crucial en la producción de 2-AG en condiciones neuroinflammatorias, hemos abordado asimismo el estudio de los cambios en la expresión del receptor P2X7 en este modelo. Asimismo, hemos estudiado el efecto de la cuprizona en ratones knockout para los receptores CB2 y P2X7, con el objetivo de profundizar en el papel de estas proteínas durante los procesos de desmielinización primaria.Como segundo objetivo fundamental de este trabajo, hemos abordado el estudio del potencial terapéutico de la MAGL como diana farmacológica en la EM, utilizando dos modelos animales. En concreto, hemos estudiado el efecto5del inhibidor selectivo JZL184 en ratones sometidos a EAE y en el modelo de administración de cuprizona en la dieta.MATERIALES Y MÉTODOSEl modelo de desmielinización por administración de cuprizona mimetiza parcialmente los hallazgos histológicos que caracterizan los patrones III y IV de las lesiones de la EM. La cuprizona es un quelante de cobre que causa la muerte de los oligodendrocitos maduros y provoca una desmielinización progresiva y una reacción inflamatoria mediada principalmente por astrocitos y microglía, sin ruptura de la barrera hematoencefálica. El modelo se caracteriza también por el reclutamiento de precursores de oligodendrocitos hacia las zonas desmielinizadas. En este estudio administramos cuprizona al 0.3% en la dieta durante 3 y 6 semanas a ratones C57BL6 para inducir desmielinización parcial y completa en el cuerpo calloso. Alternativamente, administramos el tóxico durante 6 semanas y mantuvimos los animales con dieta normal durante 2 semanas adicionales para estudiar el proceso de remielinización espontánea. En una segunda fase, administramos cuprizona en la dieta durante 6 semanas a ratones deficientes para el receptor CB2 o para el receptor P2X7.Para la inducción de EAE crónica se inmunizaron ratones C57BL6 con la proteína de mielina MOG emulsionada en adjuvante de Freund. Este protocolo induce una respuesta autoinmune que se traduce en la invasión de la médula espinal por células del sistema inmune autorreactivas frente a MOG, efecto que provoca desmielinización, inflamación, daño axonal y síntomas motores.El efecto de la inhibición de la MAGL se estudió tanto en ratones bajo tratamiento con cuprizona como en animales sometidos a EAE, utilizando en ambos casos el fármaco JZL184, cuya eficacia para aumentar los niveles de 2-AG in vivo está bien caracterizada. Los animales recibieron inyecciones diarias del inhibidor (8-32 mg/kg) durante 21 días de manera profiláctica en el caso de la EAE, y preventiva en el caso del modelo de cuprizona.6Las técnicas experimentales utilizadas en este estudio incluyen:- Análisis de la expresión génica mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real para observar cambios en la expresión de ARN mensajero en muestras de cerebro- Separación electroforética de proteínas por peso molecular y posterior inmunodetección para cuantificar cambios en tejido cerebral (western blot)- Técnicas histológicas para la detección de mielina (luxol Fast blue, LFB) y presencia de infiltrados celulares (Nissl)- Marcaje de tipos celulares (microglía, astrocitos y precursores oligodendrogliales) por inmunofluorescencia simple en secciones cerebrales y de médula espinal- Técnicas de inmunofluorescencia doble para estudiar la localización de receptores CB1 y P2X7 en diferentes tipos celulares, así como para caracterizar el fenotipo pro- o anti-inflamatorio de la microglía.- Determinación de los niveles de endocannabinoides en muestras cerebrales por espectrometría de masas- Autorradiografía de [35S]GTP¿S para comprobar la funcionalidad de los receptores CB1 en secciones de cerebroRESULTADOSLa administración de cuprizona provocó un incremento en los niveles de ARNm de los receptores CB1 y CB2. El aumento en la expresión de los receptores CB1 se corroboró a nivel de proteína mediante inmunohistoquímica, y los estudios de colocalización revelaron la expresión del receptor en células microgliales en el cuerpo calloso de ratones tratados con cuprizona. No se detectaron diferencias significativas en cuanto al nivel de desmielinización y el grado de inflamación entre animales de tipo silvestre y deficientes para el receptor CB2. El análisis de los niveles de endocannabinoides tras 6 semanas de tratamiento con cuprizona reveló una disminución en la concentración de AEA,7mientras que no se observaron cambios en los niveles de 2-AG. Este hallazgo sugiere una alteración selectiva en la expresión y/o función de las enzimas responsables de la síntesis y/o degradación de la AEA. Sin embargo, no observamos cambios en la expresión génica de NAPE-PLP y FAAH. La administración de cuprizona indujo aumentos en la expresión génica y/o proteica de las principales enzimas encargadas de la degradación de 2-AG (MAGL, ABHD6 y ABHD12). Esta observación, junto con la ausencia de alteraciones en los niveles de 2-AG, podría sugerir un incremento en alguno de los mecanismos de producción de este endocannabinoide. En este sentido, no observamos alteraciones en el nivel del ARNm de la enzima de síntesis de 2-AG DGL¿ durante el curso temporal de la administración de cuprizona. Sin embargo, el tratamiento con la toxina indujo un aumento significativo en la expresión del receptor P2X7 tanto a nivel de ARNm como a nivel de proteína. Los estudios immunohistoquímicos en cuerpo calloso revelaron la localización predominante del receptor P2X7 en microglía, tanto en condiciones basales como tras el tratamiento con cuprizona. Estos resultados sugieren que el receptor P2X7 juega un papel importante en procesos de desmielinización primaria, por lo que quisimos analizar en mayor detalle el efecto del tratamiento con cuprizona en ratones knockout para dicho receptor. Observamos una marcada reducción en el grado de desmielinización en los animales deficientes para P2X7, así como un descenso en la reacción microglial y astrocitaria. Además, los animales knockout para el receptor P2X7 presentaban una menor proporción de microglía de tipo pro-inflamatorio o M1, en comparación con los animales silvestres. En conjunto, estos datos sugieren que la activación del receptor P2X7 contribuye al proceso de desmielinizacion primaria inducido por administración de cuprizona.Para estudiar el posible efecto del bloqueo de la MAGL en procesos de desmielinización primaria, administramos durante 21 días, junto con el tóxico cuprizona, el inhibidor selectivo JZL184 (8 mg/kg). Esta administración8profiláctica atenuó de manera significativa el efecto desmielinizante de la cuprizona a nivel de cuerpo calloso. Los animales tratados con JZL184 presentaron además una menor reacción microglial y un descenso en el número de precursores de oligodendrocitos. Asimismo, el tratamiento con JZL184 durante 21 días comenzando en la fase aguda de la enfermedad redujo la sintomatología motora en ratones sometidos a EAE de manera dosis-dependiente. En este caso, la administración diaria del inhibidor a una dosis de 8 mg/kg atenuó los síntomas neurológicos más eficazmente que una dosis de 32 mg/kg. La mejoría motora en los animales tratados con la dosis de 8 mg/kg se asoció con un menor grado de desmielinización, un menor número de lesiones inflamatorias, y una menor presencia de microglía/macrófagos en la médula espinal al final del experimento. Los estudios de autorradiografía de [35S]GTP¿S revelaron una perdida dosis-dependiente de acoplamiento funcional de los receptores CB1 a proteínas Gi/o en el cerebro de los ratones tratados crónicamente con JZL184. Esta desensibilización de los receptores CB1 podría explicar, al menos en parte, la menor eficacia terapéutica de la dosis alta del inhibidor en ratones sometidos a EAE.DISCUSIÓN Y CONCLUSIONESNuestros resultados indican que el proceso de desmielinización por administración de cuprizona conlleva cambios en la señalización endocannabinoide. La expresión aumentada de los receptores CB1 y CB2 sugiere un papel del sistema endocannabinoide durante los procesos de desmielinización primaria, con posibles implicaciones para la EM. Por otro lado, la ausencia de un fenotipo claro de los ratones deficientes para el receptor CB2 en el modelo de la cuprizona sugiere la posibilidad de que los receptores CB2 no estén tónicamente activados en este modelo. Una posible explicación a este hallazgo sería un déficit en el tono endocannabinoide en este modelo, hipótesis que se sustenta en el descenso en los niveles de AEA detectado en animales tratados con cuprizona.9No observamos cambios significativos en los niveles de 2-AG, aun a pesar de que se detectó un incremento en la expresión de las enzimas responsables de su degradación. Esta aparente discrepancia podría reflejar un aumento en uno o varios mecanismos de producción de 2-AG. A favor de esta hipótesis, detectamos aumentos significativos en la expresión de los receptores P2X7 durante el proceso de desmielinización inducida por cuprizona. De manera llamativa, los animales deficientes para este receptor presentan un menor daño a la mielina y un descenso en la reacción inflamatoria asociada. Estos resultados sugieren que, independientemente de su posible papel en la producción de 2-AG, la señalización purinérgica mediante los receptores P2X7 puede ser un mecanismo patogénico en situaciones de daño primario a la sustancia blanca.En conjunto, nuestros resultados relativos a la modulación del sistema endocannabinoide en el modelo de administración de cuprizona en la dieta contrastan con hallazgos previos en modelos autoinmunes de MS como la EAE. Estos datos sugieren la existencia de alteraciones específicas en este sistema en enfermedades o procesos desmielinizantes que cursan con un componente de daño oligodendroglial primario importante como mecanismo etiopatogénico.Por otro lado, el bloqueo de la actividad de la enzima MAGL utilizando una dosis baja de JZL184 previno la pérdida de mielina y la inflamación de la sustancia blanca en el modelo de desmielinización por cuprizona. Asimismo, la inhibición terapéutica de la enzima MAGL atenuó los déficits neurológicos en ratones sometidos a EAE de una forma dosis-dependiente, y la mejoría observada se asoció a un descenso en la reducción en el daño a la mielina y en la reacción inflamatoria en la médula espinal. El tratamiento crónico con JZL184 produjo un desacoplamiento funcional de los receptores CB1 cerebrales también dosis-dependiente, hallazgo que puede estar relacionado con la falta de eficacia terapéutica del inhibidor cuando se administra a dosis altas.10Estos resultados apoyan la utilidad de aumentar la señalización endocannabinoide para el tratamiento del daño a la sustancia blanca tanto inmuno-dependiente como inmuno-independiente. En concreto, nuestros datos sugieren que la inactivación farmacológica de la enzima MAGL puede ser una nueva estrategia terapéutica para la prevención y el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes.