Use of zebrafish (danio rerio) to evaluate the efficacy of novel compounds as immunostimulants in aquaculture

Abstract

Antiguamente se creía que los océanos eran fuentes inagotables de recursos y quetenían la capacidad de alimentar a toda la población humana de forma ilimitada.Sin embargo, en las últimas décadas, con el aumento en la demanda de pescadodebido al aumento de la población y la mejora de las tecnologías pesqueras, se hasuperado el máximo de explotación sostenible de los recursos pesqueros. Dehecho, aproximadamente el 75% de los stocks pesqueros mundiales están sobreexplotados,y el mundo se enfrenta a una crisis global de las pesquerías a unaescala sin precedentes.Al mismo tiempo que los recursos pesqueros se están agotando, la producción delsector de la acuicultura está aumentado rápidamente para cubrir las necesidadesde la demanda, convirtiéndose en una industria muy importante a nivel mundial.Sin embargo, asociado al rápido crecimiento de la acuicultura hace unos años secomenzaron a utilizar técnicas de cultivo más intensivas, generando problemascomo la inevitable exposición a estrés y a enfermedades. De hecho, lasenfermedades infecciosas son una de las mayores limitaciones en el desarrollo dela acuicultura generando además importantes pérdidas económicas.Favorecer una buena salud de los peces, beneficia su sistema inmune y además lespermite protegerse mejor frente a las enfermedades. Asimismo, una buenaalimentación es vital para su correcto crecimiento y también para hacer frente auna gran variedad de agentes infecciosos y estresantes.Por el contario, una alimentación deficiente, junto con el hacinamiento en lasplantas de acuicultura, hace que proliferen patógenos oportunistas en el medioacuático, que en condiciones normales no causarían mayores problemas. Endefinitiva, la alta densidad de los cultivos hace que haya un estrecho contacto entreindividuos, provocando una disminución del crecimiento, aumento de lasusceptibilidad a las enfermedades y disminución del éxito reproductivo afectandodirectamente la producción.Así, entre las iniciativas para mejorar el bienestar de los peces, la prevención es,sin duda, la mejor opción. Algunas medidas de prevención tomadas en acuiculturason: evitar contagio de enfermedades entre piscifactorías mediante cuarentenas,mejorar la calidad del agua, y evitar factores de estrés como altas densidades y elmanejo de los stocks durante las operaciones de carga, traslado y descarga.También se ha visto, que el uso de vacunas tiene gran utilidad para la prevenciónde enfermedades. Otras estrategias, como el uso de antibióticos oinmunoestimulantes para la obtención de animales en mejores condiciones físicashan sido medidas muy eficientes.Aunque los antibióticos sean efectivos en el tratamiento o control de algunasenfermedades, existen riesgos asociados para los consumidores derivados de laaparición de resistencias bacterianas a antibióticos. Por otro lado, las vacunas sonmuy efectivas pero muy específicas para determinados patógenos e inefectivos eninvertebrados y primeros estadios de vertebrados.El uso de inmunoestimulantes en acuicultura ha aumentado en las últimas décadas.Éstos compuestos, aumentan la resistencia frente a enfermedades potenciando losmecanismos de defensa inespecíficas. Unos de los más utilizados es el ß-glucano,un polisacárido presente en la pared celular de bacterias, algas, levaduras yhongos. Otros inmunoestimulantes también utilizados en acuicultura son loslipopolisacáridos, la quitina, vitaminas, etc.El objetivo de esta tesis es desarrollar un método para poder testar el potencialefecto inmunoestimulante de moléculas como suplementos nutricional en especiescon interés en la acuicultura, de una manera preliminar rápida, eficaz y de bajocoste utilizando en el modelo animal de pez cebra.El uso del pez cebra como modelo tiene varias ventajas respecto a otras especiesde peces como por ejemplo; el pequeño tamaño, la fertilización externa, el rápidodesarrollo embrionario, la transparencia de los embriones en los primerosestadios del desarrollo, la existencia de gran cantidad de herramientas genéticas anuestra disposición y finalmente, entre otras ventajas, la cercanía evolutiva a lospeces con interés en acuicultura.Para conseguir este objetivo, en primer lugar se seleccionaron una serie de genesdirectamente relacionados con el sistema inmune innato: HSP70, IL1B, LYZ, MPO,TLR22, TNFA y TRF, para posteriormente estudiar su expresión en los primerosdías del desarrollo embrionario mediante RT-qPCR.De entre los posibles inmunoestimulantes descritos en la bibliografía, se seleccionóel ß-glucano para poner a punto toda la metodología. Para ello, se estudió su efectoen diferentes momentos del desarrollo embrionario mediante tres vías diferentesde administración: inmersión, microinyección y mediante una dieta enriquecida.Asimismo, se realizaron ensayos de expresión génica de los genes seleccionados.Los resultados obtenidos demostraron que la vía más eficaz de administración delcompuesto fue la inmersión y, además que la edad de los embriones y tiempo deexposición eran factores muy importantes a la hora de testar uninmunoestimulante. De hecho, se propone un protocolo que consiste en unaexposición desde el primer día de desarrollo hasta 5 días post fertilización (dpf), yaque es cuando se vieron más cambios en la expresión en los genes. Este protocolo(denominado E3) se puede considerar alternativo a la experimentación animalsegún la normativa europea 2010/63/EU.A continuación se procedió a evaluar el efecto de tres tipos diferentes de estrés enel desarrollo embrionario para poder testar el potencial efecto protector del ß-glucano en las larvas. Los estreses seleccionados fueron: dos físicos (choquetérmico y radiaciones ultravioleta) y uno biológico (una infección con dos cepas deuna bacteria oportunista de peces, Vibrio anguillarum). El efecto de los estreses enlarvas se observó mediante el estudio de la mortalidad, la presencia demalformaciones y la tasa de eclosión durante los 4 días posteriores al tratamiento.Una vez optimizadas las condiciones para evaluar los efectos causados por losestreses, se llevó a cabo una exposición con ß-glucano siguiendo el protocolo E3.En el caso de los estreses físicos, y tras su exposición al inmunoestimulante, no seobservó ninguna resistencia de las larvas frente a los estreses. Por el contrario, enel caso de la infección con la cepa más infecciosa de V. anguillarum si que seobservó una resistencia temporal, disminuyendo la mortalidad en las primerashoras de la infección. Sin embargo, finalmente se desechó este sistema como testpreliminar, ya que la duración total del experimento se alarga hasta los 9 dpf de laslarvas, y por lo tanto según la normativa vigente perdiendo la denominación demétodo alternativo.En paralelo, se desarrolló un modelo gnotobiótico utilizando pulsos de luz comomedida complementaria al tratamiento de antibióticos. Los animales gnotobióticosson aquellos en los que se conoce su microbiota, por lo que también incluye aaquellos con ausencia de microbiota ¿germ free¿. De hecho, estos organismos sonmuy útiles para estudiar la interacción entre un patógeno y su huésped, aunque enel presente estudio, se pretendía estudiar el efecto del ß-glucano en larvas axénicas(¿germ free¿), para ver si de esta forma podíamos aumentar la precisión del testmediante la reducción del tiempo de exposición y la reducción de la variabilidaddebida a la presencia de microbiota. Para ello, testamos el efecto de diferentesintensidades y cantidad de pulsos de luz en la mortalidad, así como en el tipo ynúmero de malformaciones a corto (6 días después del tratamiento) y largo plazo(6 meses después del tratamiento). En este último caso también se estudió elefecto sobre fertilidad y viabilidad de los descendencia.Una vez obtenidas las larvas de pez cebra sin carga microbiana, y asegurándonosque no hubiera efectos secundarios que afectaran negativamente al crecimiento ydesarrollo de las mismas, se analizó el efecto del ß-glucano en el sistema inmune,nuevamente, mediante ensayos expresión génica. Para ello, embriones de 1 dpf seexpusieron por inmersión al ß-glucano durante tres días, un día menos que en elcaso del protocolo E3. Sin embargo, no se observaron diferencias significativasentre larvas gnotobióticas y no gnotobióticas en la expresión génica. Por lo tanto,se descartó el uso de larvas gnotobióticas para evaluar el efecto beneficioso deposibles inmunoestimulantes.Finalmente, se ha validado satisfactoriamente el sistema desarrollado (E3) en estetrabajo mediante una bacteria de ensayos de efectividad sobre extractos de tresespecies de microalgas: Chlorella vulgaris, Chlorella pyrenoidosa y Spirulinaplatensis, que son fuente de posibles sustancias con actividad inmunoestimulante.Los extractos obtuvieron mediante tres procesos diferentes en los que lacomposición variaba. Se testaron liofilizados de algas, proceso de rápidadesecación de las células, extractos con alto contenido en polisacáridosestructurales de la pared celular y sobrenadantes con alto contenido enexopolisacáridos importantes en el protección celular. En el caso de C. vulgaris, nose observó ninguna actividad inmunomoduladora en ninguna de las muestrasanalizadas.En las muestras liofilizadas de C. pyrenoidosa y S. platensis tampoco se detectoningún efecto en los genes analizados. En los extractos de estas dos especies, seobservó un efecto importante en una de las muestras de S. platensis, que coincidíacon la muestra con mayor concentración de polisacáridos. En los sobrenadantes deC. pyrenoidosa y S. platensis se observaron importantes cambios en algunos de losgenes testados. También se ha detectado un efecto negativo en la actividadinmunomoduladora del almacenamiento a 4ºC en la actividad de lossobrenadantes de S. platensis.En conclusión, se ha diseñado un método alternativo fácil, rápido y de bajo costecon larvas de pez cebra para hacer una pre-selección de compuestos con posibleuso como inmunoestimulante en cría de larvas o como aditivo de alimento paraespecies de peces con interés en la acuicultura.