La línea celular b4g12 como modelo para el estudio de la función barrera del endotelio corneal. Implicación de rhoa y rac1 en la respuesta frente a estrés osmótico

Zusammenfassung

El endotelio corneal es responsable del mantenimiento de la transparencia corneal, requisito indispensable para una buena visión, al regular la hidratación de estroma de forma activa mediante bombas y transportadores. El endotelio corneal humano no tiene capacidad proliferativa in vivo y la densidad endotelial disminuye con la edad y con diversas enfermedades sistémicas u oftalmológicas, con la inflamación y con las cirugías intraoculares. Actualmente el tratamiento de las enfermedades endoteliales comprende un abanico desde el tratamiento tópico con colirios hipertónicos en los casos mas leves, hasta el trasplante corneal en los casos mas graves. Debido a la falta de modelos experimentales para el estudio de la función barrera del endotelio corneal, en este trabajo hemos optimizado el cultivo de una linea celular establecida de endotelio corneal humano, la línea B4G12, como modelo para estudiar la función barrera. La línea celular B4G12 crece con características mas similares al endotelio corneal in vivo, morfológicamente y funcionalmente, formando una monocapa confluente, con uniones intercelulares maduras y estables, cuando se cultiva sobre cubres de plástico incubados con colágeno o fibronectina. Para estudiar la función barrera, dada la sensibilidad de la línea celular al estrés osmótico hemos estudiado su respuesta. La exposición a estrés osmótico hipertónico en la línea B4G12 altera la función barrera de la monocapa endotelial al producir contracción de la actomiosina y desestructuración de las uniones intercelulares. Encontramos activación de las vías de dos de las Rho GTPasas más importantes en el control del citoesqueleto celular, RhoA y Rac1. Tras la exposición a estrés observamos un aumento de la fosforilación de MLC, necesaria para la contracción de la actomiosina, y de la fosforilación de las proteínas ERM, interconectores del citoesqueleto celular con la membrana plasmática. Ambos efectos forman parte de la vía de señalización de RhoA, y la inhibición farmacológica de ROCK, su mayor efector, con Y27632 reduce la fosforilación de MLC y de las proteínas ERM. Sin embargo, la inhibición de las vías de RhoA y Rac1 con inhibidores farmacológicos no sólo no disminuye la contracción, sino que retarda la recuperación de la monocapa endotelial tras el cese del estrés osmótico. Estos resultados junto con el hecho de que el pretratamiento con activadores de RhoA y Rac antes del la exposición al estrés osmótico estimule la función barrera, indica que la activación de ambas vías podría formar parte de un mecanismo de respuesta para recuperar la homeostasis celular. El desarrollo de un modelo experimental murino para la realización de experimentos in vivo y un mejor entendimiento de las vías implicadas en la señalización de la respuesta al estrés osmótico son pasos necesarios para el diseño de nuevos tratamientos para tratar la disfunción endotelial. Nuestros resultados muestran un posible papel de RhoA y Rac1 como posibles dianas terapéuticas para preservar la función endotelial.