Regulación farmacológica de las Map Quinasas MEK1/2 y ERK1/2 en la señalización de los receptores Gabbaa y NMDAcurso temporal de sueño inducido por agentes hipnóticos/anestésicos en cerebro de ratón

Zusammenfassung

Las proteína quinasas activadas por mitógenos (MAPK) se organizan en cascadas proteicas, formando rutas de señalización que permiten responder a una gran variedad de estímulos extracelulares. La vía de las MAPKs ERK1/2, participa en una gran diversidad de procesos fisiológicos entre los que se encuentran la proliferación, diferenciación y supervivencia celular, la modulación de la expresión génica y la formación de la memoria. La importancia de esta vía se ve reflejada en los distintos trastornos que se relacionan con su desregulación, como por ejemplo las llamadas RASopatías o diversos tipos de cáncer. En distintos estudios se ha observado que tratamientos con fármacos anestésicos/hipnóticos conllevan una reducción en los contenidos de la proteína p-ERK1/2, efecto que puede relacionarse con déficits en aprendizaje y memoria. En la presente Tesis doctoral se llevó a cabo un paradigma experimental de sueño inducido por fármacos anestésicos/hipnóticos en ratones in vivo. Se utilizaron diversos moduladores alostéricos positivos del receptor GABAA (midazolam, etanol, hidrato de cloral e isoflurano) y un antagonista no competitivo del receptor NMDA (ketamina) para la inducción de un curso temporal de sueño (rango: 25-160 min), durante el cual se fueron sacrificando ratones a distintos tiempos. Los objetivos principales del estudio fueron evaluar cómo los distintos fármacos anestésicos/hipnóticos modulan la fosforilación secuencial de las quinasas MEK1/2 y ERK1/2, así como también estudiar el papel de las formas de la proteína multifuncional FADD y el ratio indicador de neuroplasticidad p-FADD/FADD en el modelo conductual propuesto. Todos los fármacos utilizados en este trabajo redujeron significativamente los niveles de activación de las MAPKs ERK1/2 (ratio entre la forma fosforilada y la forma total). Sorprendentemente, al evaluar el contenido de sus quinasas activadoras p-MEK1/2, se observó que estas se encuentran incrementadas, indicando la existencia de una disrupción entre la fosforilación secuencial de estas dos enzimas. La relevancia de estos resultados reside en el hecho de que las MAPKs ERK1/2 son los únicos sustratos conocidos de las quinasas MEK1/2 y la activación secuencial entre ellas, es aceptada como un conocido mecanismo de señalización celular. Debido al importante papel que tiene la vía de ERK1/2 en diversos procesos celulares y el amplio abanico de respuestas fisiológicas que esta vía es capaz de generar, presenta numerosos mecanismos para la especificidad de respuesta y además se encuentra estrechamente regulada. Así, se evaluaron algunos de los mecanismos potencialmente implicados en la disrupción observada, como por ejemplo algunas de las fosfatasas responsables de la desactivación de ERK1/2 y también la forma 6 inactivada de la proteína MEK1 (p-Thr286 MEK1). Se observó que en el sueño inducido por la benzodiazepina midazolam, los contenidos de la fosfatasa MKP-3 y de p-MEK1 estaban incrementados en la corteza cerebral de ratón. Aunque en este caso los resultados obtenidos podrían haber explicado parcialmente la reducción en la activación de ERK1/2, la compleja interacción con el fármaco flumazenilo indica que otros mecanismos distintos a los estudiados deben ser los principales responsables. En el caso del barbitúrico pentobarbital y del fármaco ketamina, los niveles de p-MEK1 y MKP-3 no se vieron alterados. Durante el curso temporal de sueño inducido por los distintos fármacos anestésicos/hipnóticos de interés, se observó que los contenidos de la proteína p-FADD en corteza cerebral de ratón se encontraban significativamente incrementados en todos los casos. Estos resultados, junto con la reducción o no alteración de la forma total de la proteína FADD, llevaron a un aumento muy significativo del ratio p-FADD/FADD, pudiendo indicar la existencia de neuroplasticidad durante el transcurso del sueño inducido por fármacos anestésicos/hipnóticos. Mediante el tratamiento con flumazenilo, un ligando neutro que se comporta como antagonista alostérico del receptor GABAA, se investigó la implicación de este receptor en los efectos observados durante el sueño inducido por midazolam y ketamina. La interacción farmacológica con flumazenilo, moduló la duración del sueño inducido por ambos fármacos, indicando la implicación del receptor GABAA en los sistemas moleculares que producen el sueño inducido por midazolam y ketamina. Por otro lado, la utilización de SL-327 (fármaco inhibidor de MEK1/2) para inducir una reducción de p-ERK1/2, resultó en el incremento de la duración del sueño inducido por el fármaco ketamina. Este resultado demuestra la implicación directa de la modulación de estas MAPKs en los mecanismos responsables del sueño inducido por este fármaco. La utilización del inhibidor metabólico SKF525-A, reveló la participación de diversas proteínas (p-MEK1/2, p-ERK1/2, p-FADD y p-PEA-15) en los procesos moleculares relacionados con el sueño inducido por pentobarbital, debido al aumento observado en el tiempo de sueño inducido por el barbitúrico y a la regulación paralela y persistente de las proteínas nombradas. Por otro lado, se estudiaron algunos marcadores de neuroplasticidad (PSD-95, NF-κB) y la proteína PEA-15 durante el curso temporal de sueño inducido. El contenido del marcador de plasticidad NF-κB se vio incrementado durante el sueño inducido por los fármacos midazolam, ketamina y pentobarbital. También se encontró un incremento significativo en el contenido de p-PEA-15 en el sueño inducido por pentobarbital y ketamina (en menor medida), en concordancia con estudios previos que lo habían observado durante el sueño 7 inducido por midazolam. Estos resultados indican que PEA-15 podría tener relación con los mecanismos moleculares adyacentes al sueño inducido por fármacos, como se ha observado para las proteínas FADD y ERK1/2, con las que PEA-15 puede interaccionar y modular algunas de sus acciones. En conclusión, los resultados obtenidos en la presente Tesis doctoral indican la importancia de la señalización de ERK1/2 y de la proteína p-FADD en el sueño inducido por distintos fármacos de características muy diversas en cerebro de ratón. Además se ha descubierto una disrupción en la activación secuencial de las quinasas MEK1/2 y ERK1/2 durante el transcurso del sueño inducido por todos los fármacos anestésicos/hipnóticos utilizados. A su vez, todos los tratamientos indujeron un aumento en los niveles de p-FADD y en el ratio indicador de neuroplasticidad p-FADD/FADD. La reducción en los niveles de activación de ERK1/2 junto con el aumento del ratio p-FADD/FADD y de otros marcadores de neuroplasticidad, podrían relacionarse con algunos de los efectos adversos que presentan los fármacos anestésicos/hipnóticos, como la amnesia, tolerancia o déficits en aprendizaje y memoria.