Papel de C3G en la diseminación, tumorigénesis y señalización celular del glioblastoma

Resumen

Los glioblastomas (GBMs), o astrocitomas/gliomas de grado IV, son los tumores cerebrales más frecuentes y agresivos, cuyo diagnóstico y tratamiento es altamente ineficaz. Los receptores tirosina-quinasa (RTKs), principalmente EGFR, y sus vías de señalización están alteradas en casi el 90% de los GBMs. Los RTKs regulan la tumorigénesis, diseminación y a las células madre del GBM, una subpoblación con capacidad de auto-renovación e iniciación tumoral. La diseminación del GBM está asociada a su agresividad, y la transición epitelio- mesénquima podría favorecer su alta invasividad. C3G, proteína codificada por el gen RAPGEF1, es un factor activador del intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) de Rap1 y otras proteínas G monoméricas. Mediante mecanismos dependientes e independientes de su actividad GEF, C3G regula múltiples funciones celulares como la supervivencia, adhesión y migración. En cáncer, C3G juega un papel diferente dependiendo del estadio y contexto. Por ejemplo, en hepatocarcinoma, C3G está sobre-expresado, promoviendo proliferación, mientras que su disminución favorece la metástasis. C3G está altamente expresado en cerebro, pero su papel en GBM es desconocido. El objetivo principal de este proyecto es analizar la función de C3G en la diseminación y tumorigénesis del GBM, identificando los mecanismos implicados y las posibles interacciones de C3G con otras vías de señalización. En tumores y líneas celulares de GBM encontramos una bajada en los niveles de ARNm y proteína de C3G, comparando con controles no tumorales. Mediante silenciamiento génico de C3G en las células de GBM, U87, y en dos líneas de pacientes (12¿12D y HCO1D) y el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 se redujo o anuló la expresión de C3G. También se sobre-expresó C3G transitoriamente. La bajada en los niveles de C3G aumentó la migración/invasión de las células de GBM. Mediante western-blot, zimografía y RT-qPCR se vio que estos cambios se asociaban al aumento de marcadores mesenquimales (Vimentina), actividad MMP2 y RNAm de TWIST1 y ZEB2. A su vez, la sobreexpresión de C3G disminuyó la invasión mediante un mecanismo dependiente de su actividad GEF, demostrado al sobreexpresar el mutante de C3G sin dominio CDC25H. Además, las células de GBM con silenciamiento de C3G generaron más focos en ensayos de crecimiento dependiente e independiente de anclaje (excepto en HCO1D) y tumores de mayor tamaño in vivo, aunque la proliferación celular disminuía. Estos tumores presentaban más células estromales y vasos sanguíneos. A su vez, los niveles bajos de C3G favorecían la adquisición de propiedades progenitoras y un metabolismo glucolítico anaerobio. La búsqueda de mecanismos moleculares mostró que p38¿/ß MAPK promovía la invasión, independientemente de C3G. Por otro lado, la hiper-activación de las ERKs inducida por el silenciamiento de C3Gera responsable del aumento de invasión y formación de focos. A su vez, el silenciamiento de C3G atenuó la señalización del EGFR y su efecto sobre la invasión, disminuyendo sus niveles en la superficie celular (detectado por citometría) al estar su reciclaje inhibido. Sin embargo, según los resultados de un array anti-fosfo-RTKs, el silenciamiento de C3G daba lugar a la sobre-activación de otros RTKs como FGFR1, incrementado su fosforilación. FGF-2, presumiblemente vía FGFR1, promovía la invasión a través de la hiper- activación de las ERKs. Respecto a su relevancia clínica, cabe destacar que la identificación de estos mecanismos podría contribuir a definir una nueva firma asociada a la progresión y diseminación del GBM. Ésta debería incluir la regulación negativa de C3G asociada al incremento de los niveles de Vimentina y el aumento de la actividad de FGFR1/ERKs, entre otros. Estos resultados podrían ayudar a discriminar aquellos pacientes con potencial para responder a distintas terapias basadas en la inhibición de RTKs.