Efectos moleculares de nuevos agentes promotores de la migración celular y la reepitelización de heridasmembrana amniótica y ácido oleanólico

Resumen

La cicatrización de heridas es un proceso complejo que implica diferentes etapas que tienen como objetivo restaurar la integridad del tejido lesionado. Si se interrumpe el proceso normal de curación, se puede llegar a desarrollar lesiones no cicatrizantes conocidas como heridas crónicas. Éstas, por definición, son heridas que no son capaces de epitelizar de forma correcta y por tanto, incapaces de progresar a través de las etapas normales de la curación. La evidencia acumulada muestra como algunos agentes parecen ser capaces de revertir esta situación y facilitar la epitelización de estas heridas. Entre ellos parece destacar las habilidades de un tejido perinatal, la membrana amniótica (MA), y las de un extracto vegetal, el ácido oleanólico (AO). El objetivo principal de esta investigación es el de profundizar en el conocimiento de aquellos mecanismos moleculares por los cuales la MA y el AO pueden contribuir a la reepitelización de lesiones cutáneas. Para ello se han desarrollado numerosos experimentos orientados a evaluar los efectos de estos agentes sobre la migración y la proliferación, así como su efecto sobre el comportamiento de rutas moleculares cruciales para estos procesos. En la ejecución de esta estrategia se han empleado diferentes modelos de células epiteliales, como son las células de epitelio pulmonar de armiño (Mv1Lu), las células epiteliales de mama humana (MDA-MB-231) o los queratinocitos espontáneamente inmortalizados humanos (HaCaT). Para ponderar el efecto de la aplicación de MA y el AO sobre la migración celular, se han realizado estudios de cierre de heridas in vitro en presencia de MA o AO junto con inhibidores de rutas específicas. Esta aportación ha permitido comprender como la MA y el AO promueven la migración celular mediante la activación de la vía de las MAPK, incluyendo ERK y JNK, a parte de otras rutas aguas arriba de estas. Así se ha comprobado que la migración promovida por la MA se ve afectada por el inhibidor de la ruta de TGF-?, mientras que la migración fomentada por el AO se afecta por la inhibición del receptor de EGF. En cuanto a los efectos sobre la proliferación, en el caso de MA se había indicado por otros autores que es un agente pro-proliferativo que promueve la división celular, observación que quedó confirmada en nuestros ensayos. El AO, en cambio, parece ejercer cierta influencia negativa sobre la proliferación a corto plazo sin afectar al ciclo celular. Junto con los estudios indicados se realizaron otros de expresión génica, perfilados para concretar el efecto de MA y AO sobre genes involucrados en proliferación y migración celular. Los resultados mostraron como tanto el AO como la MA son capaces de alterar el perfil de expresión de genes relevantes implicados en la migración celular, como son el SNAI2, c-JUN y PAI-1, así como genes involucrados en la regulación del ciclo celular, como CDKN1A. Por último, para obtener una visión de conjunto, se realizó la observación microscópica mediante técnicas de inmunofluorescencia, que permiten caracterizar el efecto que la exposición a MA o AO, como agentes promotores del cierre de heridas, tiene sobre la arquitectura celular en relación con la migración celular. Así en experimentos de cierre de heridas se puede observar en el borde de la herida como la MA efectivamente atenúa la señalización nuclear de las Smad. Además, se observó como el tratamiento con MA es capaz de promover el remodelado de los focos de adhesión de células Mv1Lu y HaCaT, induciendo la expresión de Paxilina y aumentando el dinamismo de los complejos focales en las células migratorias. Además, este dinamismo se correlacionó con el aumento de la activación de la Kinasa de Adhesión Focal (FAK) en el borde de migración de células HaCaT. Con el tratamiento de AO se observó su habilidad para promover la internalización de los receptores de EGF, al igual que ocurre con el tratamiento con el ligando nativo. Todos estos datos nos llevan a proponer el concurso de diversas rutas moleculares en la migración promovida tanto por MA como por AO. Así, la estimulación de la migración celular provocada por MA estaría contribuida por un efecto atenuador de este agente sobre la señalización dependiente de TGF-? por la ruta de las Smad, un efecto observado tanto en células Mv1Lu y como en células HaCaT. Además, la MA desencadena el reclutamiento de la ruta de las MAP Kinasas involucrando al receptor de EGF, promoviendo la activación de MEK1 y la fosforilación de c-Jun en el borde migratorio, fenómeno que es crucial para el correcto cierre de la herida. Con respecto al AO, los efectos de este agente parecen implicar también la activación del receptor de EGF, abarcando esto la activación de las rutas de las MAP kinasas, y en concreto de JNK y de MEK. Todo ello conduce al desarrollo de un perfil de expresión génica coherente con la adquisición de habilidades de remodelación tisular similares a un estatus de Transición Epitelio-Mesénquima (EMT), que queda evidenciado por cambios en la cito- arquitectura y el aumento de la migración. El conocimiento de la forma de actuar de estos agentes puede abrir oportunidades para futuras innovaciones en el desarrollo para el manejo y la regeneración de heridas crónicas.