Analytical methodology for the determination of potentially effective compounds from natural products to control nosema ceranae infection in honey bee (apis mellifera)

Zusammenfassung

En los últimos años se ha venido observando una extraña desaparición de las abejas melíferas (Apis mellifera) que está afectando drásticamente a un elevado número de colmenas por todo el mundo, causando serios problemas no sólo a la apicultura sino a todas las actividades agrícolas relacionadas con la polinización. Una de las hipótesis que puede explicar estos problemas es la propagación de la nosemosis, que es una enfermedad digestiva de las abejas causadas por los microsporidios Nosema apis y Nosema ceranae. Estas pérdidas importantes de abejas se solucionaron inicialmente con la autorización provisional de la fumagilina. Hoy en día, el uso de este compuesto no está autorizado, y por consiguiente es necesario encontrar compuestos alternativos que puedan ser efectivos contra la infección por Nosema. El resveratrol y sus compuestos derivados, que han sido positivamente relacionados con beneficios para la salud de humanos y también de animales, han demostrado su potencial para controlar la infección por Nosema en abejas melíferas. Por otro lado, continúa la búsqueda de nuevos compuestos obtenidos de productos naturales que puedan ser utilizados para controlar la infección por Nosema. En la actualidad, una gran parte de la investigación relacionada con los productos naturales se ha centrado en el broccoli, y en concreto, los glucosinolatos (GLSs) y sus productos relacionados, que parecen tener una cierta actividad anticancerígena. En particular, la mayoría del estudio ha estado focalizado en un único compuesto bioactivo del broccoli, llamado sulforafano (SFN), que posee un gran potencial frente a numerosas enfermedades. Por estos motivos, puede ser interesante el investigar su potencial para controlar la infección por Nosema, y además, será necesario el extraer estos compuestos de la manera más compatible posible con el medio ambiente, si se pretende administrarlo a las abejas melíferas. En resumen, si estos compuestos (isómeros del resveratrol, GLSs y SFN) van a ser administrados a abejas melíferas, es de suponer que residuos de estos compuestos se puedan encontrar en productos apícolas, tales como la miel, la cera o el polen de abeja. Además, el análisis de los compuestos anteriormente citados en productos apícolas puede ser también de interés para verificar si han sido adecuadamente administrados, y para saber si estos compuestos pueden estar presentes en productos que serán consumidos/usados por personas y abejas. Por todo ello, el principal objetivo de esta tesis doctoral ha sido el desarrollo de metodologías analíticas para determinar resveratrol, GLSs y SFN en productos apícolas (miel, cera y polen). Para poder alcanzar esta meta, se han propuesto una serie de objetivos secundarios: i) el desarrollo, optimización y validación de métodos analíticos específicos para determinar isómeros de resveratrol y piceidos en cera y polen: ii) el desarrollo, optimización y validación de métodos de extracción eficaces, selectivos y compatibles con el medio ambiente para obtener GLSs del brócoli; iii) el desarrollo de, optimización y validación de métodos analíticos específicos para determinar GLSs y SFN en productos apícolas. Ha de comentarse que debido a las características físico-químicas de los compuestos recogidos en este estudio, la técnica analítica más adecuada paras llevar a cabo su separación y análisis es la cromatografía de líquidos (LC). Además, es posible utilizar varios detectores acoplados al LC dependiendo de cada objetivo. Por ejemplo, los GLSs y SFN son encontrados normalmente en altas concentraciones en brócoli, por lo que un detector de absorción molecular con diodos alineados (DAD) sería suficiente para detectar y cuantificar a la mayoría de los compuestos. De cualquier forma, detectores de espectrometría de masas (MS) pueden ser también utilizados para confirmar la presencia de los analitos en las muestras, y para cuantificar aquellos compuestos encontrados a concentraciones bajas en alguna de las muestras. Por otro lado, cabe esperar cantidades bajas de isómeros de resveratrol, GLSs y SFN en productos apícolas, y consecuentemente, son requeridos detectores sensibles como la MS ó MS en tándem (MS/MS) para realizar una correcta cuantificación y confirmación de los compuestos estudiados. En todos los casos, la metodología seguida para alcanzar las metas propuestas se ha desarrollado de manera análoga y con etapas similares: i) se ha llevado a cabo una exhaustiva búsqueda bibliográfica con el fin de saber el estado actual de cada tema; ii) se han seleccionado de manera preliminar las condiciones cromatográficas y de detección; iii) se han propuesto y optimizado un tratamiento de muestra eficiente; iv) las condiciones cromatográficas y de detección se han seleccionado y optimizado; v) el método propuesto ha sido adecuadamente validado y aplicado al análisis de muestras. Como resultado del trabajo realizado en esta tesis, dos métodos analíticos nuevos (cromatografía de líquidos acoplado a la espectrometría de masas, LC-MS) han sido desarrollados y validados para determinar isómeros de resveratrol y piceido (cis y trans) en cera y polen, respectivamente. En ambos casos, se han propuesto procesos de extracción eficaces, que consistían en una extracción sólido-líquido (SLE) y una posterior etapa de concentración. Se han analizado muestras de diferentes orígenes, y han sido detectados residuos de algunos de estos compuestos, lo que es un descubrimiento interesante ya que no había sido publicado con anterioridad. Ha de puntualizarse que no ha sido necesario investigar la presencia de estos compuestos en miel, debido que este estudio ya había sido realizado con anterioridad. Por otro lado, la determinación de GLSs intactos y SFN en brócoli ha sido llevada a cabo en otra parte de esta tesis. En primer lugar, se ha realizado una extensa búsqueda bibliográfica con el fin de conocer las tendencias actuales para la extracción y caracterización de compuestos potencialmente beneficiosos para la salud del brócoli, prestando especial atención a los GLSs y SFN. A continuación, se han desarrollado y optimizado, por medio del diseño de experimentos, dos métodos de extracción distintos, rápidos, eficientes y compatibles con el medio ambiente (agua caliente y extracción con líquidos presurizados) para obtener GLSs intactos de hojas de brócoli. Además, también han sido propuestas nuevas condiciones de separación (cromatografía de líquidos acoplado a detectores de diodos alineados y a la espectrometría de masas, LC-DAD-MS; y cromatografía de líquidos de ultra alta presión acoplada a la espectrometría de masas en tandem, UHPLC-MS/MS). Se ha de especificar que los experimentos con UHPLC-MS/MS han sido realizados en el Green Technology Group de la Universidad de Lund (Suecia) bajo la supervisión de la Prof. Charlotta Turner. Además, los resultados de los estudios de estabilidad han demostrado que los extractos de hojas de brócoli deben ser almacenados a bajas temperaturas (4ºC) y protegidos de la luz con el fin del mantener el mayor contenido total de GLSs intactos en estos extractos. Finalmente, se ha desarrollado y validado un método LC-DAD para analizar SFN en brócoli. El procedimiento de extracción propuesto, basado en la extracción con disolvente utilizando metil t-butil eter (MTBE) seguido de una extracción en fase sólida (SPE) con cartuchos de sílice, ha demostrado ser eficaz y más compatible con el medio ambiente que las propuestas previas. La última sección de esta tesis doctoral se ha centrado en el desarrollo de nuevas estrategias analíticas para determinar GLSs intactos y SFN en productos apícolas como la miel, cera y polen. En todos los casos, se han desarrollado y optimizado métodos de cromatografía de líquidos acoplado a la espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para separar, identificar y cuantificar los compuestos estudiados. Los GLSs intactos han sido eficazmente extraídos de polen de abeja por medio de la SLE con agua caliente, seguida de SPE con cartuchos rellenos de amino. Estos cartuchos también han sido usados para la miel, pero en este caso, la miel fue previamente disuelta en agua caliente. Un método de extracción diferente basado en tres etapas (disolución, extracción y concentración) ha demostrado ser eficaz, simple y relativamente barato (bajo consumo de disolventes) para obtener GLSs intactos en cera. Ha de señalarse que residuos de GLSs intactos han sido detectados en algunas de las muestras de polen y miel analizadas. Este es un hecho especialmente relevante en el caso de las muestras de polen, ya que no ha sido publicado con anterioridad. Finalmente, se ha desarrollado y optimizado un método de extracción eficaz de SFN en la miel, basado en una SPE con cartuchos poliméricos. Además, se ha detectado por primera vez SFN en dicha matriz de colmenas no tratadas. Como resumen, se puede decir que esta tesis doctoral ha estado dedicada a desarrollar metodologías analíticas basadas en LC acoplada a diferentes detectores (DAD; MS; MS/MS), tan rápidas, simples, compatibles con el medio ambiente y sensibles como ha sido posible, para determinar isómeros de resveratrol, GLSs y SFN en productos apícolas (miel, cera y polen), debido a que está siendo investigado el potencial de estos compuestos para controlar la infección por Nosema ceranae en abejas melíferas (Apis mellifera). Además, se han propuesto nuevos métodos de las mismas características que las anteriormente expuestas para extraer y determinar GLSs y SFN del brócoli. Finalmente, se ha demostrado que es necesario el desarrollo de métodos analíticos específicos para determinar isómeros de resveratrol, GLSs intactos y SFN en productos apícolas; dichos métodos deben ser, tal y como hemos propuesto, muy sensibles, ya que el contenido encontrado en la mayoría de los casos fue cercano al µg/kg. Además, la determinación de alguno de estos compuestos en productos que pueden ser consumidos por humanos, como la miel y el polen, les proporcionan un valor añadido, ya que se ven afectados positivamente por las propiedades beneficiosas de estos compuestos, y al mismo tiempo incrementan el valor nutricional y bioactivo de estos productos naturales.