Nuevas metodologías analíticas para la determinación de neonicotinoides en semillas, suelos y productos apícolas

Résumé

El principal reto de la agricultura moderna consiste en mejorar la calidad de la producción de alimentos evitando efectos adversos para el medioambiente. Sin embargo, las plagas que afectan a los cultivos han causado una enorme preocupación debido a las notables pérdidas en la producción agrícola. El procedimiento más utilizado para controlar las pérdidas causadas por insectos es la aplicación de semillas recubiertas con insecticidas, pues estas plagas, en su gran mayoría, se encuentran presentes en el suelo cuando se realiza la siembra. Estos insecticidas, en particular los neonicotinoides (NEOs), son rápidamente absorbidos y distribuidos a través de la planta actuando como repelentes de los insectos que atacan las plantas (o bien incluso por contacto directo) provocando interferencias en la transmisión nerviosa al unirse a los receptores nicotínicos de la acetilcolina (nAChRs). Pudiendo convertirse en metabolitos más tóxicos durante su translocación dentro de la planta, como es el caso del tiametoxam (TMX) y su posterior transformación a clotianidina (CLO). La aparición de estos compuestos en el polen o néctar de las plantas provenientes de campos tratados con NEOs ha sido relacionada con la desaparición de las abejas. La acción de estos insecticidas lleva a las abejas a cambiar su comportamiento cotidiano conduciendo a un despoblamiento de las colmenas y desaparición de los polinizadores. Este fenómeno fue denominado en EEUU como “Síndrome del colapso de colmenas” (Colony Collapse Disorder, CCD). A raíz de la creciente inquietud provocada por la desaparición de los polinizadores se han realizado numerosos estudios en diferentes países tratando de buscar los causantes de ese fenómeno. Una gran parte de esos trabajos se dirige a justificarlo por la presencia de residuos de plaguicidas procedentes de los cultivos que visitan las abejas. Recientemente se ha señalado como principal causante a los NEOs, llegándose a prohibir por las autoridades Europeas el uso de tres de ellos como recubrimiento de semillas, prohibición que era por tres años y se intenta que sea definitiva. La translocación de dichos compuestos dentro de los tejidos de las plantas después del tratamiento de las semillas puede ocasionar riesgos medioambientales no solo para las abejas sino también para otros invertebrados , el propio medio ambiente, e incluso para los humanos . Por lo tanto, la determinación de estos insecticidas en diferentes matrices ya sean alimentarias, medioambientales, etc. es un importante y actual objeto de estudio. En base a estos hechos, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral ha sido el desarrollo de metodologías analíticas que permitan evaluar los posibles residuos de NEOs tanto en matrices medioambientales (semillas de colza y suelo agrícola) como en productos de colmena (polen, miel, cera y jalea real). Teniendo en cuenta las propiedades físico-químicas de este tipo de insecticidas, baja volatilidad y alta polaridad, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es la técnica más adecuada para llevar a cabo la separación y el análisis, ya que el uso de cromatografía de gases (GC) conlleva una etapa adicional de derivatización para transformar los analitos en volátiles. Debido a que estos compuestos habitualmente se encuentran a nivel de trazas son requeridos detectores sensibles como la espectrometría de masas (MS) o MS en tándem (MS/MS). Aunque en algunos casos, son encontrados en altas concentraciones por lo que con un detector de diodos alineados (DAD) sería suficiente para confirmar y cuantificar dichos compuestos. Para alcanzar los objetivos propuestos la línea de trabajo que se ha seguido ha sido similar en todos los casos. Inicialmente se ha realizado una extensa búsqueda bibliográfica con el objetivo de conocer el estado actual de cada tema; de forma preliminar se han seleccionado las condiciones de separación y detección; se ha propuesto y optimizado un tratamiento de muestra adecuado; posteriormente se han seleccionado las condiciones cromatográficas y de detección óptimas; por último se han validado los métodos propuestos siguiendo las pertinentes guías de validación y se han aplicado Al análisis de muestras. La primera parte de esta Tesis Doctoral se ha centrado en el desarrollo y validación de dos métodos analíticos para la determinación de TMX y CLO en semillas de colza (HPLC-DAD) y suelo (HPLC-MS/MS). En ambos casos el proceso de extracción propuesto consiste en una extracción sólido-líquido (SLE) con posterior etapa de concentración. Además se realizó un estudio de estabilidad del TMX en ambas matrices (luz y temperatura). Los resultados de estabilidad han demostrado que el TMX presenta alta persistencia en semillas de colza, siendo el porcentaje de pérdida inferior al 18% en todos los casos. Por otro lado, se observó que esta perdida se encuentra directamente relacionada con la formación de CLO (metabolito principal). Se evaluó la presencia de posibles residuos en muestras de suelo agrícola procedentes de cultivos de colza, pertenecientes a campos experimentales, donde se detectó TMX en el 63% de las muestras analizadas. La segunda parte de la Tesis Doctoral se ha centrado en el desarrollo y validación de metodologías analíticas rápidas y sencillas que permitan la determinación de NEOs en productos de colmena como polen, miel, cera y jalea real. En todos los casos, se han desarrollado y optimizado métodos de cromatografía de líquidos de ultra alta resolución acoplada a la espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS). La extracción de los NEOs en polen de abeja se ha realizado empleando la metodología QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe). Se analizaron muestras de polen procedentes de diferentes regiones de España, donde se encontraron residuos de NEOs por debajo del límite de cuantificación (LOQ). Para el caso de la miel, se han propuesto dos metodologías diferentes atendiendo al origen botánico y a la coloración. Para las mieles oscuras el método de extracción propuesto consiste en una extracción en fase sólida (SPE) con cartuchos de tipo polimérico (Strata®-X); mientras que para analizar mieles claras se ha seleccionado un método basado en la metodología QuEChERS usando un medio tamponado. Los resultados han demostrado que para el análisis de NEOs en mieles es necesario aplicar distintas metodologías de extracción según el origen bótanico. Cabe destacar que este estudio no se había realizado con anterioridad, y que la validación con UHPLC-MS/MS (QqQ) ha sido realizada en el IUPA (Instituto Universitario de Plaguicidas y Aguas) de la Universidad Jaume I (Castellón de la Plana) bajo la supervisión de la Prof. María Ibáñez y el Prof. Félix Hernández. El procedimiento de extracción propuesto para la extracción de NEOs en cera de abeja se basa en una extracción sólido-líquido (SLE) seguido de un proceso de congelación y una etapa de limpieza con un sorbente comercializado recientemente (EMR-Lipid). Es la primera vez que se demuestra la efectividad de este tipo de sorbente para la reducción del efecto matriz (eliminación de lípidos) en cera de abeja. Esta metodología analítica, la cual presenta numerosas ventajas frente a las existentes en cuanto a tiempo de preparación de muestra, análisis y gasto de reactivos y disolventes, se ha aplicado para el análisis de residuos de NEOs en ceras de abeja procedentes de distintas regiones de España. Por último, se han desarrollado dos nuevas metodologías para el análisis de NEOs en productos basados en jalea real (jalea real pura y jalea real liofilizada en forma de ampollas). Para la extracción de dichos compuestos en jalea real pura se ha propuesto una microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME), mientras que para la jalea real liofilizada se ha propuesto una SPE (cartuchos Strata® X). Ha de puntualizarse que es la primera vez que se desarrolla una metodología específica para el análisis de NEOs para distintos productos que contienen jalea real. Los métodos propuestos se han empleado en el análisis de muestras adquiridas tanto en comercios locales como procedentes de apicultores tradicionales, sin embargo, no se detectó residuos de dichos compuestos en ninguna de las muestras analizadas. Como resumen, esta Tesis Doctoral ha consistido en el desarrollo y validación de nuevas metodologías analíticas específicas, sencillas y rápidas basadas en HPLC y UHPLC acoplada a diferentes detectores (DAD; MS; MS/MS), para determinar residuos de NEOs en matrices medioambientales (semillas y suelo agrícola) y matrices apícolas (polen, miel, cera y productos basados en jalea real).