Replicación y encapsidación de minigenomas RNA derivados de corona virus expresión de genes heterólogos

Abstract

El coronavirus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT) es un virus RNA de cadena sencilla y polaridad positiva, con una RNA genómico de 28.5 kb. El gran tamaño del genoma del VGPT ha dificultado hasta muy recientemente la obtención de un cDNA infectivo de longitud completa que facilite la manipulación génica del virus. Por ello, en el laboratorio nos hemos centrado en el aislamiento y caracterización de RNAs defectivos, minigenomas, de menor longitud que el genoma parental. En esta tesis se han puesto a punto dos sistemas de expresión de minigenomas sintéticos RNA derivados del VGPT bajo los promotores T7 y de citomegalovirus (CMV). Estos minigenomas son replicados y empaquetados (es decir, rescatados) en presencia de virus complementador. Mediante la obtención de mutantes de deleción de los minigenomas y el analisis de la expresión del gen trazador de la B-glucuronidasa, se han determinado las secuencias minimas necesarias para su replicación. Estas secencias se han reducido a 1164 y 278 nucleotidos en los extremos 5¿ y 3¿ del RNA viral, respectivamente. El minigenoma más pequeño que ha sido rescatado en presencia de virus complementador tiene 3.3 kb (M33), mientras que los minigenomas más pequeños que son replicados pero no encapsidados tienen 2.1-2.2 kb (M21 y M22). La diferencia entre los minigenomas en viriones del VGPT está en estudio. El mapeo de la señal de encapsidación del VGPT será de gran utilidad para diseñar vectores con un solo ciclo replicativo y que no den lugar a la aparición de virus viables por recombinacion (vectores suicidas).