ATR inhibitors as a therapeutic approach to treat tumours with high levels of replication stress

Resumen

A lo largo de los últimos años, se ha dedicado un gran esfuerzo en dirigir la terapia contra el cáncer hacia el desarrollo de compuestos quimioterapéuticos enfocados en atacar las enzimas encargadas de reparar el DNA. Con este fin, la aproximación terapéutica actual consiste en aprovecharse de una debilidad específica de las células tumorales para eliminarlas de forma selectiva, este concepto se conoce como letalidad sintética y es el modelo clave para el tratamiento del cáncer. En esta Tesis Doctoral aportamos evidencias del potencial terapéutico de bloquear la quinasa ATR en tumores con altos niveles de estrés replicativo (RS, por sus siglas en inglés), un tipo de daño específico del DNA inducido por oncogenes y suprimido por las enzimas ATR y CHK1. Basándonos en estudios previos de nuestro laboratorio, hemos establecido la hipótesis de que los tumores con altos niveles de RS pueden identificarse en base a altos niveles de expresión de CHK1. Siguiendo esta lógica, hemos identificado un subtipo de leucemia mieloide aguda (AML) y el tumor sólido Sarcoma de Ewing, los cuales responden favorablemente al tratamiento con inhibidores de ATR. Nos hemos centrado en el subtipo de AML iniciado a partir de reorganizaciones cromosómicas del oncogén MLL (AML-MLL). Las células tumorales de AML-MLL son resistentes a las terapias genotóxicas actuales debido a que presentan una respuesta atenuada del supresor tumoral p53, lo que implica un pronóstico desfavorable para esta enfermedad. En esta tesis, demostramos que la inhibición in vitro de ATR provoca la eliminación de células de AMLMLL de ratón, independientemente de la respuesta de p53 que presenten. Además, la inhibición de ATR genera una actividad anti-tumoral in vivo en un modelo de AMLMLL en ratones inmuno-suprimidos y en xenotransplantes de una línea celular humana de AML-MLL. Cuando el RS es persistente conlleva la rotura de la horquilla de replicación y la generación de roturas de doble cadena en el DNA. En relación a esto, describimos que la inhibición de ATM, una quinasa relacionada con ATR que responde al daño por roturas de doble cadena en el DNA, también mejora la supervivencia de los ratones con AMLMLL. El Sarcoma de Ewing es un tumor pediátrico originado por una translocación cromosómica, mayoritariamente EWS/FLI. Este tumor puede remitir mediante cirugía y radiación en un estadio temprano; sin embargo, cuando se disemina por metástasis no tiene cura. Varios estudios han demostrado que el Sarcoma de Ewing es altamente sensible al daño en el DNA por lo que el tratamiento actual implica agentes genotóxicos. Sin embargo, se desconoce la razón por la cual estos tumores responden a dicha terapia. En este trabajo demostramos que el Sarcoma de Ewing presenta altos niveles endógenos de RS, lo cual le hace particularmente dependiente de la actividad de ATR. Asimismo, dos inhibidores independientes de ATR evaluados como agentes terapéuticos únicos demuestran eficacia in vitro en líneas celulares de Sarcoma de Ewing y eficacia in vivo en xenotransplantes de este tumor. La expresión de las translocaciones cromosómicas EWS/FLI o EWS/ERG es suficiente para sensibilizar a otras líneas celulares de distinta naturaleza al Sarcoma de Ewing a los inhibidores de ATR. En resumen, esta Tesis Doctoral confirma la utilidad de los niveles de expresión de CHK1 como un biomarcador de tumores con altos niveles de RS y aporta dos ejemplos preclínicos de la eficacia de los inhibidores de ATR en dichos tumores. Over the past years, among the general chemotherapeutic approaches for cancer treatment, multiple efforts have focused on targeting DNA repair enzymes. In this regard some approaches aim to exploit cancer-specific defects to selective kill tumour cells; a concept known as synthetic lethality that has arisen as a key model for the treatment of cancer. In this Doctoral Thesis, we provide evidence of the therapeutic potential of targeting the ATR kinase for the treatment of cancers bearing high levels of replication stress (RS), a specific type of DNA damage which is induced by oncogenes and suppressed by ATR and CHK1. Based on previous work from our laboratory, we hypothesised that tumours with high levels of RS could be identified on the basis of expressing high levels of CHK1. Following this rationale, we here identified a liquid tumour (subtype of acute myeloid leukaemia (AML)) and a solid tumour (Ewing Sarcoma), as two cancer types that respond well to a treatment with ATR inhibitors. In what regards to AML, we focused on the subtype that is initiated by chromosomal rearrangements of the MLL oncogene (AML-MLL). AML-MLL tumour cells are resistant to current genotoxic therapies because of an attenuated response by p53, which confers a bad prognosis to this disease. Here, we show that in vitro ATR inhibition induces the death of mouse AMLMLL cells independently of p53. More importantly, ATR inhibition presents anti-tumour activity in vivo in an immunocompetent allograft mouse model of AMLMLL and in xenografts of a human AML-MLL cell line. When RS is persistent it leads to the breakage of replication forks and the generation of DNA double strand breaks. Along these lines, we also found that inhibition of ATM, an ATR-related kinase that responds to DNA double strand breaks, also promoted the survival of the AMLMLL mice. Regarding Ewing Sarcoma, these are paediatric bone tumours that arise from a driver translocation, most frequently EWS/FLI1. While the tumour can be cured by surgery and radiation in its earliest stages, metastatic disease has no cure. Several studies have shown a high sensitivity of Ewing Sarcoma to DNA damage, and current treatment involves genotoxic agents. However, the basis for the sensitivity to these therapies remains unknown. We here show that Ewing Sarcomas suffer from high endogenous levels of RS, rendering them particularly dependent to the ATR kinase. Accordingly, two independent ATR inhibitors show in vitro toxicity in Ewing Sarcoma cell lines as well as in vivo efficacy in Ewing Sarcoma xenografts as single agents. Expression of EWS/FLI1 or EWS/ERG oncogenic translocations suffices to confer sensitivity to ATR inhibitors in non-Ewing Sarcoma cell lines. Collectively, this Doctoral Thesis confirms the usefulness of CHK1 levels as a biomarker of tumours with high levels of RS, and provides two preclinical examples of the efficacy of ATR inhibitors in cancer therapy.