Ingeniería enzimática de quitina desacetilasas y glicosintasas como biocatalizadoresDiseño racional de la especificidad y evolución dirigida

Resumen

Los resultados presentados en esta tesis están divididos en dos capítulos en función de los enzimas estudiados: quitina desacetilasas y glicosintasas. Las de-N-acetilasas de quitina (CDAs) son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de los grupos acetamido de los residuos GlcNAc de quitina, quitosano y oligosacáridos de quitina (COS). Las CDAs pertenecen a la familia 4 de las esterasas de carbohidratos (CE4), la cual también incluye esterasas de acetilxilano y desacetilasas de petidoglucano. Los quitosanos son polisacáridos de N-acetil-glucosamina y glucosamina. Los COS y derivados parcialmente desacetilados (paCOS) han demostrado ser moléculas bioactivas en un amplio rango de aplicaciones como pueden ser antimicrobianos, inmunoestimulantes, nano formulaciones para drug o gene delivery, promotores de crecimiento vegetal, promotores de la cicatrización de heridas, etc. La mayoría de las actividades biológicas asociadas a los paCOS parecen depender no solo del grado de polimerización (DP) y de acetilación (DA), sino también del patrón de acetilación (PA). Esta relación estructura función remarca el rol crucial de las CDAs. Los objetivos de esta tesis comprenden los estudios de la relación estructura-función dentro del marco del Subsite Capping Model. La presencia de varios loops rodeando el sitio activo, los cuales varían en tamaño y estructura en función de la CDA, definen los subsitios accesibles en el surco catalítico y, a su vez, también son responsables de definir el patrón de desacetilación. En esta tesis se reporta la validación de una metodología analítica HPLC-MS para la monitorización de la actividad de CDAs, la demostración experimental del Subsite Capping Model usando la desacetilasa de quitooligosacáridos de Vibrio cholerae y los resultados del diseño racional de los loops para la modulación de la especificidad de sustrato. Varias generaciones de mutantes fueron estudiadas obteniéndose como resultado un enzima altamente optimizado. El otro capítulo incluye el trabajo realizado en el campo de las glicosintasas. Estas enzimas se han convertido en unas eficientes herramientas para la síntesis de oligosacáridos, glicoconjugados y polisacáridos. Se derivan de glicosidasas con retención de conformación anomérica en las que la actividad hidrolítica ha sido abolida por la mutación del nucleófilo catalítico pero que catalizan eficientemente reacciones de transglicosilación cuando se les proporcionan donadores activados con fluoruro con la configuración anomérica opuesta a la del sustrato del enzima hidrolítico parental. Mejorar el rendimiento de las glicosintasas actuales (y futuras) y la ingeniería de la especificidad por sustratos artificiales están siendo afrontadas por metodologías de evolución dirigida. Estas aproximaciones dependen en gran medida de métodos de alta eficiencia de cribado. En este trabajo se presenta un método de cribado independiente de la especificidad del enzima para el cribado de bibliotecas de glicosintasas basado en un quimiosensor fluorescente de fluoruro capaz de transducir la actividad glicosintasa a fluorescencia. Se describe el desarrollo y validación del ensayo así como su aplicación a una biblioteca de saturación del residuo nucleófilo en la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis. Además, se encuentra un nuevo y sorprendente mutante que es posteriormente caracterizado, el mutante E134D. Esta nueva glicosintasa proporciona conocimiento mecanistico sobre el rol de los residuos adyacentes en la reacción catalítica de las glicosintasas.