Endocannabinoid modulation of astroglial cells in multiple sclerosis

Resumen

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central (SNC) y una de las principales causas de discapacidad en adultos jóvenes. La principal característica de la EM es la acumulación de lesiones desmielinizantes en el cerebro y la médula espinal, áreas en las que las vainas de mielina de los axones han sido dañadas, provocando inflamación y degeneración axonal. El deterioro de la vaina de mielina interrumpe el procesamiento de la señalización neuronal, lo que provoca déficits neurológicos. Aunque la etiología de la EM sigue sin estar clara, está ampliamente aceptado que estas lesiones están causadas por linfocitos autorreactivos que migran a través de la barrera hematoencefálica (BHE), promoviendo la activación glial y la neurodegeneración crónica.Los astrocitos son la principal población glial en el SNC. Estas células participan en una amplia gama de funciones en el cerebro durante el desarrollo y en la etapa adulta, incluyendo la homeostasis deiones, el reciclaje de neurotransmisores, la formación y el mantenimiento de la BHE, la señalización inmune, la mielinización y la transmisión sináptica. Las células astrogliales también participan en el mantenimiento, la eliminación y remodelación de las sinapsis durante el desarrollo, el envejecimiento y en situaciones de daño celular. Los astrocitos sufren una pronunciada transformación en situaciones neuropatológicas, denominada astrogliosis reactiva, que implica cambios a nivel genómico, morfológico y funcional específicos para cada contexto. Entre las causas que pueden promover la astrogliosis reactiva se encuentran (i) la liberación de citoquinas pro-inflamatorias en respuesta a una lesión del SNC, (ii) los patrones moleculares asociados a daños (DAMPs), (iii) los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) producidos por una infección microbiana y, (iv) el estrés oxidativo o químico. La microglía es crucial para regular el fenotipo de los astrocitos durante la patología del SNC. Las células microgliales activadas producen gran cantidad de moléculas pro-inflamatorias que promueven el reclutamiento de leucocitos y la citotoxicidad de oligodendrocitos y neuronas. Recientemente, se ha propuesto un mecanismo por el cual la microglía promueve la inducción de una población neurotóxica de astrocitos reactivos, denominada A1, mediante la liberación de diversas moléculas inflamatorias como interleucina-1¿ (IL-1¿), factor de necrosis tumoral-¿ (TNF¿) y el componente del complemento 1q (C1q). Este subconjunto de astrocitos reactivos A1 se caracteriza por la regulación al alza del componente del complemento 3 (C3) y se ha identificado en numerosas enfermedades neurodegenerativas, incluida la EM. Los astrocitos neurotóxicos A1 presentan un perfil transcriptómico marcadamente pro-inflamatorio, pierden funciones astrocíticas fisiológicas, liberan sustancias que dañan a las neuronas y a los oligodendrocitos e inhiben la remielinización. Está bien establecido que la activación de los astrocitos juega un papel importante en la inflamación crónica y el daño neurodegenerativo en la EM y en su modelo murino de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). En modelos experimentales se ha demostrado que modular la función de este tipo celular in vivo previene las respuestas inflamatorias y atenúa el daño neurológico durante la progresión de la enfermedad. En base a estas observaciones se ha postulado que la identificación de los factores que promueven la actividad patógenica de los astrocitos en la EM contribuirá al desarrollo de tratamientos terapéuticos novedosos y más exitosos.Clásicamente, los astrocitos han sido considerados células no excitables, ya que, a diferencia de las neuronas, no generan potenciales de acción. Sin embargo, esta definición no es totalmente correcta, ya que estas células presentan unas dinámicas de calcio (Ca2+) complejas y altamente controladas que son fundamentales para la señalización intracelular y la comunicación intercelular. Los astrocitos responden con elevaciones del Ca2+ citosólico a una amplia variedad de neurotransmisores liberados por las neuronas y, posteriormente, liberan una plétora de moléculas neuroactivas, denominadas gliotransmisores, incluyendo glutamato, ATP, D-serina y GABA. En las células astrogliales, las señales de Ca2+ son dependientes de la actividad celular y regulan directamente las funciones biológicas de estas células, contribuyendo a la integración y el procesamiento de la información sináptica, la modulación de la transmisión sináptica, la plasticidad sináptica y el comportamiento. En varios trastornos neurológicos como en la enfermedad de Alzheimer, Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica, entre otras, los astrocitos presentan una señalización de Ca2+ desregulada. Sin embargo, el papel que juegan las dinámicas de Ca2+ astrogliales durante la EM se desconoce.El sistema endocannabinoide es un sistema neuromodulador implicado en una gran variedad de procesos fisiológicos, como el movimiento, la memoria y la cognición, el estado de ánimo, el dolor, la regulación de la temperatura y el apetito, entre otros. El sistema endocannabinoide está integrado por los receptores cannabinoides, principalmente receptores cannabinoides de tipo 1 (CB1Rs) y de tipo 2 (CB2Rs), sus ligandos endógenos, denominados endocannabinoides, y las enzimas encargadas de la biosíntesis y degradación de estos compuestos. Los endocannabinoides pueden definirse como ungrupo de mensajeros lipídicos sintetizados a partir de componentes de la membrana celular. Aunque se han identificado varias moléculas, los lípidos N-araquidoniletanolamina (anandamida, AEA) y 2-araquidonilglicerol (2-AG) son los endocannabinoides mejor caracterizados. Ambos se sintetizan bajo demanda, normalmente en respuesta a elevaciones del Ca2+ intracelular. Las principales vías para la biosíntesis de los endocannabinoides 2-AG y AEA implican reacciones catalizadas por las isoformas ¿/ß de la diacilglicerol lipasa (DAGL¿/ß) y la N-acil fosfatidiletanolamina fosfolipasa D (NAPE-PLD), respectivamente. El 2-AG es metabolizado principalmente por las hidrolasas monoacilglicerol lipasa (MAGL), dominio ¿/ß-hidrolasa 6 (ABHD6) y 12 (ABHD12). En cuanto al metabolismo de la AEA, la amida hidrolasa de los ácidos grasos (FAAH) es la principal hidrolasa de la AEA en el tejido nervioso, aunque las acciones fisiológicas de esta y otras N-aciletanolamidas también pueden ser terminadas por amidasas de lípidos alternativas, como la N-aciletanolamina amidasa ácida (NAAA). Recientemente, se han identificado una serie de proteínas de unión a ácidos grasos (FABP) que actúan como transportadores intracelulares de endocannabinoides, principalmente AEA. Los CB1Rs se expresan predominantemente en el cerebro, mientras que los CB2Rs se localizan principalmente en las células periféricas del sistema inmunitario. Los CB1Rs son uno de los receptores acoplados a proteínas G más abundantes en el cerebro de los mamíferos y median los efectos psicoactivos del cannabis. Las áreas cerebrales con altos niveles de CB1Rs incluyen el hipocampo, la corteza cerebral, los ganglios basales y el cerebelo, donde desempeñan funciones neuromoduladoras relevantes en la fisiología cerebral. En cuanto a la distribución celular de los CB1Rs, estas proteínas se localizan principalmente en las neuronas maduras del SNC. En particular, los CB1Rs se expresan en niveles más altos en neuronas GABAérgicas y en menor medida en neuronas glutamatérgicas del cerebro anterior. La mayoría de los CB1Rs neuronales se encuentran en los terminales presinápticos de los axones y están implicados en el mantenimiento de la homeostasis de las sinapsis, regulando negativamente la liberación de neurotransmisores a través de la inhibición de los incrementos de Ca2+ citosólico que promueven la liberación de neurotransmisores. Por otro lado, la presencia de CB1Rs en las células gliales también ha sido demostrada de forma indiscutible durante la última década. En particular, se ha demostrado que los astrocitos expresan cantidades significativas de CB1Rs que desempeñan un papel crucial en la función astroglial. En especial, juegan un papel importante en la regulación de la función sináptica afectando directamente al comportamiento y la memoria, además de estar crucialmente implicados en la regulación del metabolismo energético. Por otro lado, es bien conocido que tanto astrocitos como microglía participan en la biosíntesis y el metabolismo de los compuestos endocannabinoides. Sin embargo, el papel de las células neurogliales como dianas y mediadores de la señalización endocannabinoide en la EM ha sido escasamente analizado.Hoy en día está bien establecido que los compuestos (endo)cannabinoides exhiben propiedades neuroprotectoras y anti-inflamatorias en la EM mediados por receptores CB1Rs y CB2Rs. Sin embargo, los mecanismos subyacentes y la especificidad celular de los efectos observados no se comprenden completamente. Se ha descrito que los efectos beneficiosos de los agonistas cannabinoides en la EM se deben en parte a la activación de CB1Rs neuronales, que promueven la protección contra la excitotoxicidad por altos niveles extracelulares de glutamato. Esta hipótesis se basa en la observación de que los ratones que carecen de CB1Rs presentan una escasa tolerancia a la excitotoxicidad y desarrollan daños neuronales más graves y síntomas más severos durante la EAE. Por otro lado, los CB1Rs expresados en los astrocitos inducen elevaciones intracelulares de Ca2+ que promueven la liberación de glutamato entre otros gliotransmisores. Este mecanismo está implicado en el deterioro de la memoria asociada al uso de cannabinoides y puede contribuir al desarrollo de un entorno excitotóxico en enfermedades neuroinflamatorias como la EM. Sin embargo, las implicaciones de la señalización endocannabinoide mediada por los astrocitos en la EM son básicamente desconocidas.En el contexto mencionado, el objetivo global de esta Tesis Doctoral es ampliar el conocimiento actual sobre el papel del sistema endocannabinoide en la modulación de los astrocitos en la EM, con especial énfasis en los CB1Rs astrogliales. Nuestros objetivos específicos son los siguientes:Objetivo 1. Investigar posibles cambios en la señalización endocannabinoide en astrocitos y microglía en el contexto de su alteración fenotípica durante la EAE.Objetivo 2. Evaluar el acoplamiento funcional de los CB1Rs a la señalización de Ca2+ intracelular en los astrocitos activados en el contexto de la EAE utilizando enfoques complementarios in vivo e in vitro.Objetivo 3. Evaluar el fenotipo de los ratones mutantes condicionales que carecen de CB1Rs astrocíticos en el modelo EAE utilizando técnicas histológicas, moleculares y de imagen de Ca2+ in vivo.Nuestros resultados muestran que la activación de los astrocitos durante la EAE se asocia a alteraciones transcripcionales tempranas que afectan a numerosas moléculas relacionadas con la señalización endocannabinoide. Además, los astrocitos adquieren un fenotipo neurotóxico asociado a un perfil de expresión génica pro-inflamatorio que sugiere deficiencias en el mantenimiento y/o promoción de las sinapsis, así como en la capacidad de fagocítica de estas células durante el curso temporal de la EAE. En segundo lugar, nuestros resultados identifican los CB1Rs astrogliales como mediadores de los efectos del ¿9-THC sobre la dinámica de Ca2+ citosólico en astrocitos de la corteza somatosensorial del ratón in vivo y muestran una desregulación de la señalización de Ca2+ en estas células, tanto espontánea como en respuesta a estímulos, durante la progresión de la EAE. Por último, los ratones en los que los CB1Rs han sido específicamente eliminados en astrocitos presentan una reducción de la severidad de los síntomas motores y discapacidad neurológica durante el curso temporal de la EAE. A nivel histológico, estos animales exhiben menor área desmielinizada y número de lesiones desmielinizantes, junto con una menor infiltración de linfocitos T, un descenso en la reactividad astroglial y una reducción del daño neuroaxonal. Este fenotipo protector se acompaña de descensos en la expresión de genes relacionados con señales pro-inflamatorias, con la activación y el reclutamiento de linfocitos T y con el fenotipo astroglial neurotóxico A1, así como con aumentos en los niveles de marcadores sinápticos/neuronales. Finalmente, la deleción de CB1R astroglial se asocia a una menor desregulación de las dinámicas de Ca2+ astroglial durante la EAE. Por tanto, nuestros datos sugieren que los CB1Rs astrocíticos exacerban la discapacidad neurológica y la neuroinflamación durante la EAE, señalando un papel previamente desconocido del sistema endocannabinoide en la fisiopatología de la mielina.Las principales conclusiones de nuestro estudio son las siguientes:I. Los astrocitos incrementan la expresión de genes asociados al fenotipo neurotóxico durante la progresión de la EAE, apoyando así un papel patogénico de este subconjunto de astrocitos reactivos en la EM. Por otro lado, la microglía muestra un estado de polarización intermedio en cuanto a la expresión de genes inflamatorios durante la EAE.II. Los astrocitos y la microglía activados durante la desmielinización autoinmune muestran alteraciones transcripcionales específicas a nivel celular que afectan a las moléculas asociadas al sistema endocannabinoide y que sugieren una desregulación de este sistema de señalización en ambos tipos celulares en la EM.III. Los astrocitos corticales muestran déficits de señalización de Ca2+ espontánea y evocada por estímulos durante la EAE que se correlacionan en parte con la discapacidad neurológica.IV. Los astrocitos activados in vitro e in vivo muestran cambios en la expresión génica de moléculas relacionadas con la señalización de Ca2+, así como respuestas citosólicas de Ca2+ alteradas al glutamato y al ATP que pueden contribuir a los déficits de señalización de Ca2+ observados in vivo.V. La activación de los CB1Rs astrogliales provoca respuestas robustas de Ca2+ citosólico en astrocitos corticales in vivo que se encuentran disminuidas durante la EAE. En el contexto de estudios anteriores, estas observaciones sugieren déficits en la comunicación entre astrocitos y neuronas mediada por endocannabinoides que contribuirían a cambios en la comunicación sináptica en la EM.VI. La supresión genética de los CB1Rs en los astrocitos atenúa la severidad de la EAE y previene los déficits de señalización de Ca2+ asociados a la progresión de la enfermedad a través de mecanismos que pueden implicar la modulación del reclutamiento de células T y microglía/macrófagos y la conversión neurotóxica de los astrocitos.En conjunto, estos hallazgos amplían el conocimiento existente sobre los mecanismos que median los beneficios/efectos secundarios de los tratamientos cannabinoides en la EM y sientan las bases para futuras investigaciones dirigidas a desarrollar nuevos fármacos moduladores del sistema endocannabinoide más eficaces para tratar esta enfermedad neurológica.