Desarrollo de anticuerpos terapéuticos contra el receptor ccr6 humano

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis: Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) representan el 4% del genoma humano y son una de las dianas terapéuticas más atractivas debido a que median muchas funciones fisiológicas importantes [1]. Estos receptores se caracterizan por tener siete hélices transmembrana con tres bucles intracelulares, tres bucles extracelulares, un dominio extracelular amino terminal y un dominio intracelular carboxilo terminal. La señalización de los GPCRs es un proceso complejo que puede llevarse a cabo a través de las proteínas G o que puede ser independiente de las mismas [2]. El receptor CC de quimioquinas 6 humano (CCR6h) es un GPCR de clase A característico de linfocitos T, tanto ayudadores (Th17) como reguladores (Treg), células linfoides innatas-3 (ILC-3), neutrófilos, células natural killer (NK), células B y células dendríticas inmaduras [3, 4]. CCR6 es una diana con un gran potencial terapéutico ya que cuando se une a su ligando, CCL20, se produce una red de señalización que está implicada en procesos relacionados con un gran número de enfermedades como cáncer, psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple o infección por VIH [3]. El eje CCR6-CCL20 influye en los sistemas reproductivo, gastrointestinal, esquelético y reproductivo a través de mecanismos inmunitarios pleiotrópicos. Hay estudios que indican que tras la unión de CCL20 a CCR6 se activa una miríada de vías de señalización a través de las proteínas G heterotriméricas y de las β-arrestinas [5]. Esta interacción ha tenido tradicionalmente dos papeles fundamentales en inmunología, como par involucrado en la homeostasis inmunológica y como par conductor en inflamación y autoinmunidad, principalmente a través de las células Th17 [6]. En enfermedades inflamatorias la función de CCR6 es crítica manteniendo la homeostasis de leucocitos a través del reclutamiento de las células Th17 y Tregs a los sitios de inflamación. Las células Th17 expresan CCR6 y citoquinas inflamatorias, como IL-17, que están implicadas en la propagación de respuestas inmunes inflamatorias [7]. El receptor CCR6 juega un papel particularmente importante a través del reclutamiento de células Th17 proinflamatorias a los sitios de inflamación. Por tanto, CCR6h es una diana potencial contra enfermedades inflamatorias y autoinmunes [8]. La generación de anticuerpos relevantes contra GPCRs con la especificidad y la funcionalidad requerida sigue siendo un reto. Un factor crítico es la obtención de cantidades suficientes de antígeno funcional en un formato biológicamente relevante. Los GPCRs a menudo tienen una baja expresión a nivel celular y son muy inestables cuando están purificados. El formato ideal de antígeno debería ser homogéneo, estable y debería contener las modificaciones postraduccionales relevantes. Habitualmente, los anticuerpos obtenidos no tienen efecto en la función del receptor y tiene utilidad limitada como agentes terapéuticos [9-11]. A pesar de ser una de las clases más grandes de proteínas, la mayoría de los GPCRs no tiene fármacos asociados y aproximadamente tan solo 100 GPCRs son diana de pequeñas moléculas o péptidos. Los anticuerpos dirigidos a GPCRs ofrecen una alternativa a los fármacos convencionales constituidos por pequeñas moléculas, que a menudo no tienen éxito, y pueden proveer de nuevas y valiosas opciones de tratamiento [12]. Los anticuerpos monoclonales tienen muchas aplicaciones que hacen deseable su uso en la farmacología experimental y, hoy en día, están bien establecidos como modalidad terapéutica [13]. En comparación con los fármacos químicos, los anticuerpos terapéuticos tienen muchas ventajas en términos de mayor especificidad de diana, afinidad, selectividad y otras propiedades farmacológicas y, por tanto, muestran menos efectos secundarios [14-17]. Hasta la fecha, no existe ningún anticuerpo terapéutico aprobado dirigido hacia CCR6 [18] y desarrollar un anticuerpo monoclonal antagonista podría ser una potencial alternativa a los fármacos convencionales formados por pequeñas moléculas y una estrategia efectiva para el tratamiento de ciertas enfermedades inflamatorias y autoinmunes. Un anticuerpo antagonista de CCR6h sería un tratamiento potencial para pacientes con enfermedades relacionadas con el eje CCR6h-CCL20. Por ello, el objetivo de este estudio fue desarrollar un anticuerpo monoclonal antagonista dirigido hacia el receptor CCR6h. 2. Contenido de la investigación: En este trabajo se generaron anticuerpos monoclonales contra el receptor CCR6h inmunizando ratones BALB/c con células que sobre-expresaban dicho receptor. En primer lugar, se obtuvieron células con una alta expresión del receptor con las que se inmunizaron los ratones. Se tituló el suero de los ratones inmunizados mediante ELISA para seleccionar aquel ratón con mayor título de anticuerpos para realizar la fusión. Tras la fusión de los esplenocitos del ratón seleccionado con células de mieloma NS1, se obtuvieron células híbridas, llamadas hibridomas, y se hizo una primera selección de aquellos hibridomas productores de anticuerpos CCR6h mediante citometría de flujo. Posteriormente, se realizó un segundo cribado evaluando la capacidad antagonista de los anticuerpos producidos en el sobrenadante de los hibridomas seleccionados. Para ello, se realizaron ensayos para medir la inhibición de la señalización a través de dos vías diferentes: la ruta de flujo de calcio y la señalización mediada por β-arrestina. Aquellos hibridomas productores de anticuerpos con mejor capacidad de inhibición fueron clonados mediante el método de dilución limitante para obtener anticuerpos monoclonales. De este modo se obtuvo el anticuerpo 1C6, seleccionado por mostrar mayor capacidad antagonista y mejor señalización en citometría que los otros clones, que fue purificado y caracterizado en mayor profundidad. Mediante citometría de flujo se evaluó la especificidad del anticuerpo purificado 1C6 por el receptor CCR6h demostrando que tenía una alta afinidad por el receptor incluso a bajas concentraciones. También se demostró que el anticuerpo 1C6 es específico del receptor CCR6 humano y no se une a otros receptores de la misma familia, ni al receptor ortólogo de ratón. Mediante ELISA y citometría de flujo, se determinó el epítopo de unión del anticuerpo, resultando ser un anticuerpo de unión al dominio amino terminal del receptor CCR6h. También se evaluó la capacidad del anticuerpo 1C6 para neutralizar la señalización del receptor CCR6h a través de las vías dependiente e independiente de proteína G, mediante ensayos de flujo de calcio y de reclutamiento de β-arrestina, respectivamente. Se determinó que el anticuerpo 1C6 es capaz de bloquear la señalización mediada por el reclutamiento de β-arrestina con una IC50 de 10,23 nM, sin embrago, no inhibe la señalización por flujo de calcio. Además, se realizaron ensayos de quimiotaxis en los que se demostró que el anticuerpo 1C6 reduce la migración de células que expresan CCR6h hacia su ligando CCL20. Finalmente, se estudió a través de ELISA si el anticuerpo 1C6 afecta a la producción de citoquinas por las células Th17, ya que estas expresan CCR6. Se determinó que el anticuerpo no afecta a la producción de CCL20, pero produce una reducción de la producción de IL-17A por las células Th17. Esta disminución de la producción de IL-17 fue confirmada en el análisis de la expresión de IL-17 en células Th17 mediante RT-qPCR. 3. Conclusión: En conclusión, en el presente trabajo se aplicó la inmunización con células enteras que sobre-expresaban CCR6h para obtener con éxito un anticuerpo específico y selectivo del receptor CCR6h. Por lo tanto, este método de inmunización proporciona un enfoque eficiente para obtener anticuerpos terapéuticos dirigidos hacia GPCRs. El anticuerpo obtenido, llamado 1C6, es capaz de neutralizar la señalización de receptor, reducir la migración de células que expresan CCR6 y la expresión de IL-17 en células Th17. Estos resultados indican que el anticuerpo 1C6 posee características que lo convierten en una atractiva herramienta terapéutica en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el receptor CCR6h. 4. 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