Synthesis and evaluation of polymer-based nanocarriers for siRNA delivery

Resumen

El Siglo XX se han logrado importantes avances en la investigación de esta novedosa área, con el objetivo de trasladar a la clínica nuevas terapias basadas en RNAi. El ARN pequeño de interferencia (siRNA, por sus siglas en inglés) es el principio activo de estos nuevos fármacos y está cuidadosamente diseñado para unirse al mRNA del gen diana. En el citoplasma celular, una serie de proteínas interactúan tras la unión del siRNA con el mRNA, provocando la degradación del transcrito y evitando así la producción de la proteína asociada al mRNA a silenciar. De esta forma, una enfermedad provocada por una mutación genética podría verse claramente mitigada sin necesidad de modificar la secuencia de ADN.No obstante, el potencial de esta nueva terapia se ha visto limitado debido a la naturaleza del siRNA, que dificulta su administración in vivo de forma sistémica. El ARN es un material tremendamente sensible a enzimas nucleasas, ubicadas en todo el organismo, las cuales degradan cualquier ARN exógeno. El siRNA (con una longitud entre 20 y 25 pares de bases) posee un tamaño reducido que se filtra fácilmente en los glomérulos haciendo que su tiempo de circulación sea muy corto. Otra de las barreras que presenta la administración de siRNA es la dificultad para dirigirlo específicamente al tejido diana y su correspondiente internalización celular. El siRNA no es lo suficientemente pequeño para entrar por difusión simple y su carga negativa provoca que sea repelido por componentes de la membrana celular, también de carga negativa. Además, la entrada del siRNA en el citoplasma se realiza mediante la formación de un endosoma, desde el cual tendrá que liberarse para no terminar siendo degradado en el lisosoma. Todas estas barreras hacen imposible la administración por vía intravenosa del siRNA libre y es necesaria su unión a vectores de distinta naturaleza.La nanomedicina y el diseño de nanomateriales para el transporte de fármacos ofrece vías para la introducción sistémica de material genético foráneo. Los nanovectores proporcionan protección al siRNA frente a las nucleasas, evitan su eliminación por la orina y permiten su acumulación en un tejido especifico. Son capaces de traspasar la membrana plasmática y posibiltan al siRNA escapar del endosoma. Sin la ayuda de estos vectores la aplicación del siRNA no sería posible, salvo en ciertos tejidos y órganos que permiten la captación del siRNA de forma libre tras una administración local. Sin embargo, los nanomateriales tienen que cumplir una serie de características para poder ser utilizados como vectores. Principalmente deben tener la capacidad de interaccionar con el material genético y tener la habilidad de encapsularlo. Se han desarrollado distintos tipos de nanomateriales que pueden actuar como vectores, la mayoría de ellos comparten la característica común de que presentan una carga eléctrica positiva que les permite interaccionar con la carga negativa de los fosfatos en el material genético. Entre las distintas estrategias para el desarrollo de nanovectores encontramos, entre otras, el uso de lípidos y polímeros catiónicos, nanopartículas inorgánicas recubiertas de material catiónico, exosomas y moléculas covalentemente unidas al oligonucleótido. La mayoría de las terapias más avanzadas en ensayos clínicos utilizan vectores basados en lípidos que forman liposomas o nanopartículas lipídicas (LNPs) y siRNAs unidos a un trímero de N-acetilgalactosamina (GalNac). Ambos vectores tienen como diana proteínas de la membrana de los hepatocitos, por lo que su administración se ve limitada al hígado. En 2018 fue aprobado ONPATTRO, el primer medicamento basado en el siRNA para el tratamiento de la amiloidosis hereditaria por transtirretina, que utiliza como vector LNPs. A este fármaco le siguieron otros (GIVLAARI and OXLUMO) usando también el hígado como diana y utilizando conjugados GalNac como vector. La mayoría de los ensayos clínicos realizados se han enfocado en enfermedades hepáticas principalmente por limitaciones de los vectores. Encontrar nuevos transportadores funcionales para explotar el potencial del siRNA es fundamental para el desarrollo de nuevas terapias más allá del hígado. Por ello continúan los esfuerzos en mejorar y desarrollar nuevos vectores. En esta tarea cobran un papel relevante los materiales poliméricos que presentan una gran versatilidad para ser modificados y producidos a gran escala, además de poseer una gran capacidad de encapsulación del material genético.A lo largo del desarrollo de esta tesis se han investigado dos estrategias orientadas al diseño de un nuevo vector para siRNA. Una de ellas está basada en la funcionalización catiónica del dextrano, un polisacárido de origen natural y la otra basada en la modificación con grupos hidrofóbicos de la polialilamina, un polímero sintético que contiene una amina primaria por unidad repetitiva.En el Capítulo 3 se recoge el trabajo realizado con el polímero dextrano, que se utilizó para la formación de nanopartículas de cadena única (del inglés, single-chain polymeric nanoparticles SCPN). El empleo de SCPNs como vectores se consideró como una estrategia prometedora debido al pequeño tamaño de partículas obtenidas y por los buenos resultados previos alcanzados en el transporte de antibióticos con estas nanopartículas. Para poder formar las SCPNs, los anillos de glucosa del dextrano fueron previamente modificados con grupos metacrilato, los cuales se conjugaron posteriormente con una molécula tiolada (3,6-dioxa-1,8-octano-ditiol, DODT) mediante la adición de Michael. El DODT presenta grupos tiol en ambos extremos que reaccionan con los grupos alqueno de una sola cadena de polímero, induciendo su colapso en una nanopartícula. Se introdujo un exceso de grupos metacrilato parala posterior modificación de la SCPN con grupos catiónicos, reaccionando nuevamente los grupos metacrilato restantes con la cisteamina, una molécula que presenta un grupo tiol y un grupo amino, a través de la adición de Michael. Así, la nanopartícula adquirió una carga positiva y pasó a denominarse SCPN-NH2. La modificación del dextrano con estos nuevos grupos fue caracterizada por resonancia magnética nuclear confirmando el éxito de la reacción. La misma estrategia de sustitución con cisteamina se aplicó al dextrano sin entrecruzar para obtener un sistema de control, que se denominó DXT-NH2 y de esta forma poder estudiar el efecto del entrecruzamiento en las propiedades de transfección. Se obtuvo un grado de sustitución de cisteamina del 21% en SCPN-NH2 mientras que con DXT-NH2 se obtuvo un 42%. Las aminas protonadas permiten el encapsulamiento del material genético debido a las interacciones electrostáticas con grupos aniónicos del siRNA y a la vez favorecen el escape endosomal debido al efecto tampón que producen durante la acidificación del endosoma. El tamaño de las partículas SCPN-NH2 se analizó por dispersión dinámica de la luz, obteniendo tamaños de 15 nm muy similares a las SCPN sin modificar. El análisis del potencial Z confirmó la carga positiva del SCPN aminado.Se conoce como poliplejo a la interacción entre un polímero y material genético. Esta interacción puede variar en función de la cantidad de polímero frente a la cantidad de material genético existente, es lo que se conoce como ratio N/P. El ratio N/P representa los moles de aminas protonables (N) presentes en el polímero dividido entre los moles de grupo fosfato (P) presentes en el material genético. En el caso de la presente tesis se utilizó como material genético siRNA y se formaron poliplejos con los polímeros de dextrano obtenidos. Se estudió dicha interacción mediante la técnica de retraso en gel (del inglés, gel retardation assay) a diferentes ratios N/P, en el que se confirmó la interacción con siRNA de las SCPN-NH2 y del polímero DXT-NH2. Además, se observó que a mayores ratios N/P, mayor es la encapsulación conseguida. Por otro lado, se estudió la viabilidad de la línea celular de pulmón A549 en presencia de estos dos materiales y ninguno de los ellos resultó ser citotóxico hasta concentraciones de 50 g/mL. La internalización del material genético en las células fue evaluada por medio de microscopia confocal de fluorescencia tras marcar los vectores con el fluoróforo Rhodamina B y por otro lado, utilizando un siRNA marcado con carboxifluoresceina. Las imágenes de microscopía confocal se tomaron 24 horas después de la administración de los compuestos en las células A549. Los resultados obtenidos muestran la colocalización de DXT-NH2 y de siRNA en el interior celular. Sin embargo, las células tratadas con SCPN-NH2, presentan tan solo las nanoparticulas en el interior, pero no el siRNA.Posteriormente se realizó el ensayo de eficacia del siRNA, transfectando con los vectores SCPN-NH2 y DXT-NH2. Para este estudio se utilizó la línea celular A549-GFP, que expresa de forma estable la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés). Las células fueron transfectadas con los vectores de dextrano acomplejando un siRNA anti-GFP, diseñado para bloquear el mRNA de la proteína GFP. La eficacia del siRNA se evaluó 96 horas después de la transfección, midiendo la fluorescencia media de las células mediante citometría de flujo. Ninguno de los vectores mostró una reducción de la producción de proteína, mientras que el control positivo Lipofectamina RNAimax (vector comercial basado en lípidos) redujo la expresión de GFP hasta un 80%. Se decidió entonces no continuar con el uso de las nanopartículas de cadena única como vectores de siRNA debido a su incapacidad de llevar el fármaco al interior celular tras el ensayo de internalización y a la baja eficacia de transfección obtenida. Sin embargo, continuaron los esfuerzos para la modificación de la cadena de dextrano debido a los resultados positivos obtenidos en el ensayo de internalización y con el objetivo de mejorar la eficacia de silenciamiento.El dextrano se modificó con diferentes moléculas aminadas con la idea de proporcionar una mejora en la liberación del siRNA de la cavidad endolisosomal. Se estudiaron las siguientes moléculas aminadas que fueron seleccionadas de acuerdo al número de aminas primarias, secundarias o terciarias presentes en la molécula y a sus pKas, con el objetivo de mejorar la capacidad tampón del polímero en el interior del endosoma: espermina, 1-(3-aminopropil)imidazol, Tris (2-aminoetill)amina y 3,3'-(piperazina-1,4-diil)bis(propan-1-amina). Para la funcionalización del dextrano se utilizó el reactivo de Traut como mediador entre el alqueno del grupo metacrilato y el grupo amino.De acuerdo con la literatura, también se tuvo en cuenta el peso molecular del dextrano como posible causa de una baja liberación del siRNA del endosoma, ya que pesos moleculares más altos provocan interacciones más fuertes con los oligonucleótidos, impidiendo de esta forma una buena liberación. Para ello, se funcionalizaron con cisteamina dos dextranos de peso molecular 6KDa y 20 KDa.Todas estas nuevas modificaciones en los polímeros se caracterizaron mediante resonancia magnética nuclear y se formularon con siRNA anti-GFP. Después, los poliplejos obtenidos fueron evaluados como posibles vectores mediante el ensayo de reducción de GFP. Este ensayo permite de manera rápida, sencilla y cuantitativa discriminar nuevos materiales por su eficacia de silenciamiento. Los resultados obtenidos por citometría de flujo muestran una mejora respecto a las sustituciones con cisteamina, siendolas sustituciones con espermina, Tris (2-aminoetill) amina y 3,3'-(piperazina-1,4-diil)bis(propan-1-amina) los mejores vectores. Sin embargo, ninguno de los polímeros superó una reducción del 50% de proteína, ni se acercaba a los valores del 20% de expresión obtenidos con el control positivo Lipofectamina RNAimax.Por ello en el Capítulo 4 se desarrolló otra estrategia que consistió en la modificación de un polímero sintético de alta densidad amínica, en lugar de intentar introducir grupos amino en una cadena polimérica. La polialilamina es un polímero cuya unidad repetitiva presenta una amina primaria, la cual despierta el interés como vector de material genético. Sin embargo, es sabido que una alta densidad amínica puede derivar en citotoxicidad, es por ello que se buscó modificar la polialilamina con ácido oleico para neutralizar parcialmente su carga, buscando un equilibrio entre eficacia y toxicidad.El ácido oleico se seleccionó debido a la alta eficacia de transfección demostrada en vectores lipídicos. Se estudió el efecto del grado de sustitución unido covalentemente a la polialilamina en su capacidad como vector para el transporte y liberación de siRNA. Se realizaron 5 sustituciones de ácido oleico a equivalentes molares 1:0,01; 1:0,02; 1:0,05; 1:0,1 y 1:0,2 -NH2: -COOH, las cuales se nombraron PAH.OA.1, PAH.OA.2, PAH.OA.5, PAH.OA.10 y PAH.OA.20, respectivamente. El ácido oleico se unió a la amina del monómero de PAH por medio de la formación de un enlace amida gracias a la activación del ácido carboxílico mediante carbodiimida e hidroxisuccinimida en una mezcla de disoluciones de dimetilsulfóxido (DMSO) y agua. Los nuevos polímeros fueron caracterizados mediante diferentes técnicas analíticas: Por cromatografía de capa fina se reveló la ausencia de ácido oleico libre en la muestra tras la purificación por diálisis. Por medio de espectroscopia de infrarrojo se demostró la presencia de ácido oleico presente en el polímero mediante unión covalente con el mismo. La determinación del grado de sustitución fue la tarea más compleja de llevar a cabo debido a la poca solubilidad de la polialilamina sustituida con ácido oleico. Se probaron diferentes solventes para disolver la poliamina substituida, de los cuales el agua resultó ser el más eficaz. Sin embargo, la insolubilidad del polímero no permitió una cuantificación exacta del grado de sustitución mediante resonancia magnética nuclear, pero si estimaciones que resultaron ser 1%, 2%, 6%, 14% y >20% para los polímeros PAH.OA.1, PAH.OA.2, PAH.OA.5, PAH.OA.10 y PAH.OA.20. También se emplearon otras técnicas para determinar el grado de sustitución como análisis elemental y análisis por termogravimetría, pero ambas resultaron ser tan solo estimaciones.La baja solubilidad de la poliamina modificada con oleico se debe a la formación de nanopartículas en agua por medio de autoensamblaje de las cadenas poliméricas, a través de interacciones hidrofóbicas entre las cadenas de oleico. El tamaño de las partículas se determinó por dispersión dinámica de la luz y por microscopia electrónica de transmisión. Se obtuvieron partículas de 10 nm que se agregaban en estructuras más grandes alcanzando tamaños entre los 100 y 300 nm dependiendo de la cantidad de ácido oleico unido. Las partículas formadas presentan una carga superficial positiva, alcanzando valores de Potencial Z de +40 mV aproximadamente en todas las sustituciones.Se estudió la interacción de siRNA con estas partículas poliméricas, preparando los complejos con distintos ratios N/P 2,5; 5; 10 y 15. Los poliplejos resultantes se caracterizaron por tamaño, carga superficial y eficacia de encapsulación. Se observó que los poliplejos formados por polímeros de mayor cantidad de oleico (PAH.OA.5, PAH.OA.10 y PAH.OA.20) presentan tamaños similares a las partículas formadas solo por polímero, pero los complejos con siRNA presentan una polidispersidad menor. Por otro lado, los polímeros menos sustituidos (PAH.OA.1 y PAH.OA.2) sí que vieron reducido su tamaño. La carga superficial se redujo a +30 mV, debido a la compensación de cargas de las aminas por los fosfatos del siRNA. La eficacia de encapsulación se cuantificó con Quant-IT Ribogreen obteniendo encapsulaciones por encima del 90% en todos las sustituciones y ratios N/P.La evaluación de la poliamina sustituida con ácido oleico como vector de siRNA se detalla en el Capítulo 5 donde se llevaron a cabo distintos ensayos de los complejos polímero/siRNA. En primer lugar, se evaluó la viabilidad y el daño de la membrana de las células A549 tras la exposición a los poliplejos formados con las poliaminas substituidas. Se pudo observar que los polímeros con mayor cantidad de acido oleico resultaron ser menos citotóxicos que los menos sustituidos. Sin embargo, altas cantidades de polímero en ratios N/P 15 resultan citotóxicas en todas las sustituciones. El ratio idóneo resultó ser N/P 5 donde la viabilidad celular se mantiene por encima de un 95%. La internalización de los poliplejos se evaluó por microscopia confocal y citometría de flujo. Para estos experimentos se modificaron covalentemente todos los polímeros con el fluoróforo Atto633 y se utilizó siRNA-6-FAM, marcado con carboxifluoresceina. Por microscopia confocal se pudo observar la colocalización del polímero y del siRNA en el interior celular para todos los complejos a un N/P 5. La citometría de flujo reveló que de 10.000 células observadas, el 70% presentaron fluorescencia del siRNA en todos las sustituciones de polialilamina con ácido oleico, demostrando que el grado de sustitución no influye particularmente enmejorar la internalización celular. La eficacia de administración de los polímeros se midió por citometría de flujo, utilizando células que expresan GFP y tratándolas con siRNA anti-GFP. En este experimento ya mencionado en el Capítulo 3, las células A549-GFP se expusieron a una transfección de 24 horas con los complejos formados con las distintas sustituciones de polialilamina. A las 96 horas de la transfección se midió la fluorescencia media de las células por citometría de flujo y a diferencia de los experimentos de internalización, se pudo observar que el porcentaje de ácido oleico influye en la liberación de siRNA en el interior celular. Los poliplejos con sustituciones mayores de oleico, PAH.OA.5 y PAH.OA.10, se obtuvieron mejores eficacias de transfección que para los poliplejos con menor grado de sustitución, PAH, PAH.OA.1 y PAH.OA.2. Sin embargo, con los poliplejos formados con PAH.OA.20 no se obtuvo ningún silenciamiento. El sistema más eficiente se obtuvo con PAH.OA.10 con una reducción de proteína de hasta un 70%, niveles muy similares al 80% obtenido con el control positivo Lipofectamina RNAimax.El punto más destacable de este estudio es que el ácido oleico mejora la eficacia de silenciamiento de la polialilamina, sin embargo, ésta no viene dada por una mayor capacidad de internalización celular, sino por una liberación del endosoma más efectiva. Se llevó a cabo un estudio más detallado de la liberación por parte del siRNA de la cavidad endolisosomal, mediante la colocalización del lisosoma con el siRNA hasta 48 horas de exposición. Las imágenes de microscopia confocal revelan que parte del siRNA consigue liberarse del endosoma, sin embargo hay que puntualizar que una gran cantidad del siRNA también colocaliza con el lisosoma. Aun así, esa pequeña parte de siRNA libre es capaz de inducir el silenciamiento.Dados estos resultados prometedores, se decidió estudiar la eficacia de estos vectores con un siRNA terapéutico utilizado en el tratamiento de cáncer de pulmón mediante el silenciamiento de la CD47. La CD47 es una proteína de transmembrana que se expresa en la mayoría de las células del organismo, con una especial sobreexpresión en tumores como el de cáncer de pulmón de células no pequeñas. La proteína CD47 tiene un papel en la modulación del sistema inmune, ya que es reconocida por los macrófagos a través del receptor SIRP, situado en la membrana del mismo. La CD47 actúa como una señal de no me comas y evita que las células donde está expresada esta proteína sean fagocitadas por los macrófagos. Por otra parte, ante la ausencia de la CD47, esta unión no puede llevarse a cabo y se inicia el proceso de fagocitosis.Una estrategia terapéutica interesante consiste en reducir la expresión de la proteína CD47 por medio del silenciamiento génico e inducir la fagocitosis de células tumorales. Se llevaron a cabo varios ensayos para evaluar la reducción de la expresión del gen CD47 en células A549 a nivel de transcrito y a nivel de proteína siguiendo la transfección con siRNA anti-CD47 utilizando los vectores de polialilamina modificada con ácido oleico.El contenido de ARN mensajero de CD47 se midió por PCR cuantitativa, observándose una reducción en la expresión de CD47 hasta el 70% con el vector PAH.OA.10, coincidiendo con los porcentajes de transfección medidos por citometría de flujo para el silenciamiento de GFP. El mismo vector con un siRNA negativo no indujo ningún cambio en la expresión, descartando cualquier posible efecto del polímero en los resultados de transfección. Se midió el nivel de proteína en las células con tres técnicas de biología molecular: Western Blot, Inmunofluorescencia y citometría de flujo, demostrando el buen funcionamiento del polímero PAH.OA.10 como vector y anticipando su aplicación futura en el desarrollo de terapias contra el cáncer de pulmón, y a otras nuevas dianas posibles.